济阴颗粒对去势雌性血脂异常大鼠的影响＊

赵磊，李淼，黄赫，刘禾，朱竞赫，甘雨，刘小虎＊＊，梁茂新，2，李国信＊＊

（1.辽宁省中医药研究院科研处沈阳110034；2.辽宁中医药大学药学院大连116600）

血脂异常一般指血浆中脂质异常，通常表现为血浆中甘油三酯（TG）和（或）总胆固醇（TC）升高，也包括低密度脂蛋白（LDL-C）升高和高密度脂蛋白（HDLC）降低。血脂异常是冠心病、心肌梗死和缺血性脑卒中等疾病的独立危险因素[1]，49.2%的心肌梗死与其相关，且女性比男性相关性更强[2]。近30年，中国人群血脂异常患病率逐年递增[3]。女性绝经后的发生率明显上升[4]，患病率高达72.80%[5]，可见女性患病的特殊性和严重性。故围绝经期及绝经后的血脂管理对于减轻女性长远期疾病负担具有关键意义[6]。近年来，许多研究也发现女性血脂异常与雌激素关系密切，GPR30/PPARγ/MAPK是与二者皆相关的信号通路，具有重要的调控作用。

目前治疗女性血脂异常的方法并没有充分意识其患病的特殊性，一般在发现疾病后采用常规降血脂类药物控制，缺乏具有针对性的防控措施，同时患者需要终身服药，经济负担较重。若在调节绝经综合征的同时能够干预脂质代谢过程则可达到有效防治目的，事半功倍。中医认为血脂归于“痰”类，“痰之本无不在肾”。绝经期妇女“年过四十，而阴气自半也”“七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通”肝肾阴虚明显。济阴颗粒是利用自身研制的“《普济方》数据库管理系统”，总结古代用药规律，结合现代临床经验筛取所得，由生地黄、淫羊藿、丹参、香附、黄柏组成，滋补肝肾，理气活血。前期研究表明[7-9]，济阴颗粒可有效调节绝经综合征症状、雌激素水平，抑制卵巢细胞凋亡，且5味中药分别可抑制脂肪酸、胆固醇合成，促进脂肪分解代谢等，具有现代药理学调节血脂作用。因此，本研究考察济阴颗粒治疗去势雌性血脂异常大鼠的疗效及其对GPR30/PPARγ/MAPK信号通路的影响，为女性围绝经期和长远期疾病，如血脂异常、冠心病防治，中药新药研发提供新思路、新方法。

1 材料

1.1 动物

SPF级、雌性SD大鼠75只，体质量160-200 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。实验大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心。饲养条件：温度20-25℃，湿度40-50%，自由饮食饮水。水及饲料均经辐照消毒处理。所有研究人员人道地进行动物实验，遵守动物实验的各项伦理条例。

1.2 药品

注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：F8008502）；阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号：X67405）、珍珠灵芝片（湖南正清制药集团股份有限公司，国药准字Z43020830）；济阴颗粒〔生地黄、淫羊藿、丹参、香附、黄柏免煎颗粒剂（江阴天江药业有限 公 司，批 号：18334517、18112331、19032831、19051161、19032251）〕。

1.3 主要试剂

胆固醇、丙基硫氧嘧啶、吐温-80、1,2-丙二醇、胆酸钠（成都华夏化学试剂有限公司，批号：P354464、P436521、P354672、P453641、P243652），TG、TC酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2019）、G蛋白偶联受体30抗体（GPR30）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、过氧化酶活化增生受体γ（PPARγ）抗体（上海酶联生物科技有限公司，批号：AD03031236、AI09293131、AI09064702）、β-actin（Immunoway公司，货号：YT0099）、IgG（HRP）（Abcam公司，批号：GR3208239-1）、反转录试剂盒（Takara Bio公司，货号：RR047A）、实时定量PCR染料〔SYBR qPCR Master Mix(Universal)，货号：R01001〕。

1.4 主要仪器

Neofuge 13R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）、DR-200BS酶标分析仪（无锡华卫德朗一起有限公司）、光电显微镜（奥林巴斯中国有限公司，BX53）、LBY-N6COMPACT全自动血液流变仪（北京普利生仪器有限公司）、连续波长酶标仪（美国MolecularPevices）、实 时 定 量PCR仪（ABI7500）、NanoDrop2000超微量分光光度计。

2 方法

2.1 造模

适应性喂养2天后，腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉，去除双侧卵巢。术后腹腔注射青霉素3天预防感染，取阴道分泌物涂片检测动情周期。确认未出现动情期后进行造模，每天给予脂肪乳剂（胆固醇10 g，猪油25 g，丙基硫氧嘧啶1 g，吐温-80 25 mL，1,2-丙二醇20 mL,胆酸钠2 g，蒸馏水30 mL）灌胃（10 mL/kg·d）[10]，连续8周。

2.2 分组和给药

依据前期研究，空白组与假手术组的各项指标未出现统计学差异，因此采用随机数字表法分为空白组、模型组、西药对照组（阿托伐他汀钙片）、中药对照组（珍珠灵芝片）、济阴颗粒组，每组15只。空白组和模型组蒸馏水灌胃（10 mL·kg-1）；西药和中药对照组根据临床剂量换算为大鼠剂量给予药物灌胃干预（10 mL·kg-1）；依据前期研究结果[8,9]，济阴颗粒中剂量（7.8 g生药/（kg·天））与高剂量组（15.6 g生药/（kg·天））对雌激素、卵巢衰老、冠心病心电图、心肌酶的影响各有参差，差异不显著，综合考虑选择7.8 g生药/（kg·天）作为本次实验干预剂量，连续8周。

2.3 标本采集和检测方法

末次给药后禁食、水24 h。腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉取血进行血液流变学检测，分离血清后ELISA法检测TC和TG；取肝脏1叶去除脂肪组织，10%多聚甲醛溶液固定，HE染色观察肝细胞形态，免疫组织化学法检测GPR30、MAPK、PPARγ蛋白表达；1叶-80℃保存，荧光RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA表达（表1）。

表1 基因引物信息

2.4 统计分析

3 结果

3.1 对肝脏细胞形态的影响

空白组肝细胞索放射状分布，肝细胞结构完整、大小均匀、排列整齐。模型组肝细胞索失去正常结构、细胞呈空泡性脂肪变性，核固缩染色较深，部分凋亡或坏死，大量炎症细胞浸润，肝组织损伤显著。与模型组比较济阴颗粒组肝细胞索结构基本恢复，细胞形态比较完整（图1）。

图1 济阴颗粒对肝脏细胞形态的影响（光镜×400）

3.2 对血液流变性的影响

与空白组比较，模型组大鼠低、中、高切变率下全血粘度均显著升高，组间差异显著（P<0.01）；与模型组比较，西药、中药对照组、济阴颗粒组大鼠低、中、高切变率下全血粘度显著降低，统计学意义显著（P<0.01），血液流变性有不同程度改善（表2）。

表2 济阴颗粒对血液流变性的影响（±s，n=15）

表2 济阴颗粒对血液流变性的影响（±s，n=15）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 对血清TC、TG的影响

与空白组比较，模型组血清TC、TG水平显著升高（P<0.01），表明血脂异常大鼠造模成功；与模型组比较，西药、中药对照组、济阴颗粒组血清TC、TG水平降低，统计学差异显著（表3）。

表3 济阴颗粒对血清TG、TC的影响（±s，n=15）

表3 济阴颗粒对血清TG、TC的影响（±s，n=15）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 对肝脏GPR30、PPARγ、MAPK蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组GPR30、PPARγ蛋白表达降低，MAPK蛋白表达升高，统计学差异显著（P<0.01）；与模型组比较，西药对照组、济阴颗粒组GPR30蛋白表达显著升高（P<0.01），西药对照组、济阴颗粒组（P<0.01）、中药对照组（P<0.05）PPARγ蛋白表达水平升高，西药对照组、济阴颗粒组（P<0.01）、中药对照组（P<0.05）MAPK蛋白表达水平降低（表4、图2~图4）。

表4 济阴颗粒对肝脏GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表达的影响（MOD/μm2，±s，n=6）

表4 济阴颗粒对肝脏GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表达的影响（MOD/μm2，±s，n=6）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

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图2 济阴颗粒对肝脏GPR30蛋白表达的影响（光镜×400）

图4 济阴颗粒对肝脏MAPK蛋白表达的影响（光镜×400）

3.5 对肝脏Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组Bcl-2 mRNA表达明显降低（P<0.01）。与模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组Bcl-2 mRNA表达均上调（P<0.05），调节强度相当；与空白组比较，模型组Bax mRNA表达显著增强（P<0.01）。与模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组均可抑制Bax mRNA表达（P<0.01），调节强度相当。

4 讨论

血脂异常是一类常见的代谢类疾病，与血糖升高或糖尿病有紧密联系[11]；脂质过高与炎症促进、颈总动脉内膜中层厚度之间呈正相关[12]，是心脑血管疾病重要风险因素。研究表明，45岁前男性TC平均水平和高胆固醇血症患病率高于女性，而在45岁之后女性高于男性，女性绝经后高胆固醇血症患病率增加，提示围绝经期及绝经后是女性血脂异常防治的关键时期[13]，是防控冠心病、心梗、脑梗的重要阶段。

图3 济阴颗粒对肝脏PPAR-γ蛋白表达的影响（光镜×400）

中医认为血脂与古代“脂”、“膏”的论述相似，归为“痰饮”、“湿浊”、“瘀血”之类[14]。因此，临床多以活血化瘀、祛痰除湿为主要治疗手段。然而，血脂异常实为本虚标实：脏腑功能失常为本，则水液运化和疏布异常，痰浊内生，留于血脉，阻滞气血，而成痰瘀内阻为标。肾为先天之本，主水，调节津液；肝主疏泄，调畅气血，绝经期女性肝肾阴虚[15]，津液代谢失调，津液停聚、痰浊内蕴、阴虚失于润泽，津枯血燥，膏脂疏布、运化障碍而不得藏，外泄于血脉则血脂异常。济阴颗粒方中生地黄养阴生津，为君药；淫羊藿补肾阳，强筋骨，阳生阴长为臣药；生地黄配伍淫羊藿滋补肝肾。香附行血中之气、疏肝解郁；丹参活血祛瘀；香附配伍丹参调气和血。黄柏清热燥湿为佐药，协助君臣清虚热，具有坚肾阴功效，合而滋补肝肾、理气活血。现代药理学研究：经生地黄水煎总提物干预后肝组织中泡沫细胞数量、胆固醇酯含量、胆固醇流出率明显减少[16]；丹参涉及的生物过程包括调理血脂水平[17]，减少脂肪酸和内源性胆固醇合成[18]；淫羊藿醇提物具降血脂活性[19]，减少白色脂肪堆积；香附乙醇提取物可降低随衰老而增长的总胆固醇、甘油三酯、LDL，VLDL[20,21]；黄柏中小檗碱可通过AMPK[22]、JNK[23]多种途径上调LDLR的表达来降低胆固醇[24]。本研究显示，模型组大鼠全血粘度升高，血清TC、TG升高，变化显著，出现高血脂症状。经济阴颗粒干预后，血液流变性改变减少，血清TC、TG水平降低（P<0.01），提示济阴颗粒能够改善血液及血清内血脂含量。

GPR30是G钙蛋白偶联受体又是雌激素受体，对血压和胆固醇代谢具调节作用[25]，是心血管疾病性别特异性的决定因素，女性围绝经期和绝经后患病的关键因子。GPR30激活后促使肝素结合表皮生长因子从细胞膜上释放，使得MAPK级联活化[26]。有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通过C/EBPβ和PPARγ调节前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化[27]。抑制MAPK信号通路可以激活PPARγ[28]。PPARγ在脂蛋白脂肪酶的作用下调整葡萄糖含量，再通过影响3-磷酸甘油进而影响TG的最终合成[29,30]；调节棕色脂肪组织促进脂肪燃烧，产生热量[31]；增加白脂肪组织中ADP表达，活化AMPK，从而启动脂质代谢酶的基因转录[32]。脂肪形成过程中MAPKs/Akt/PPARγ的降低有助于抑制脂肪细胞的分化，在脂质蓄积过程中阻断MAPK信号通路来抑制NF-κB的激活[33]。本研究发现，与模型组比较，经济阴颗粒干预后，大鼠肝组织中GRP30、PPARγ蛋白表达水平升高，MAPK蛋白表达明显降低，提示济阴颗粒对去势雌性血脂异常大鼠的干预作用可能是通过GPR30/PPARγ/MAPK信号通路的调节来实现的。

表5 济阴颗粒对肝脏Bcl-2，Bax mRNA表达的影响（RQ，±s，n=3）

表5 济阴颗粒对肝脏Bcl-2，Bax mRNA表达的影响（RQ，±s，n=3）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

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肝脏是脂质代谢的重要器官，肝细胞受损导致脂代谢异常，而脂肪过度积累又是导致肝代谢障碍的最重要因素。因此，肝细胞凋亡伴随着脂代谢异常的发生发展。Bcl-2和Bax是同一家族成员，在调节细胞凋亡[34]预防肝脏病变[35]中起到重要作用，Bax可通过对线粒体的调节，促进线粒体释放细胞色素c，推进凋亡过程，而Bcl-2的作用正相反[36]。通过HE染色观察肝组织形态，荧光RT-PCR法检测肝细胞凋亡因子表达，与空白组相比，模型组Bax mRNA表达升高，Bcl-2 mRNA表达降低，出现明显的细胞丢失、空泡变性等凋亡情况，肝细胞受损严重。经济阴颗粒干预后肝组织中Bax mRNA表达降低，Bcl-2 mRNA表达升高，肝细胞形态好转，提示济阴颗粒可通过降低肝细胞凋亡进而保护肝脏。

综上所述，济阴颗粒能够缓解去势雌性血脂异常大鼠肝组织损伤，改善血脂代谢、全血粘度，降低TC、TG水平，GPR30/PPARγ/MAPK信号通路可能是其作用机制之一。也就是说，济阴颗粒在调节绝经期综合征，延缓卵巢衰老的同时可有效干预女性绝经后血脂异常，对女性围绝经期和绝经后血脂异常的预防和治疗具有一定意义，在女性疾病防治的关键时期发挥重要作用，降低女性长远期疾病的患病风险。但本病发病机制较复杂，济阴颗粒也可能通过其他途径发挥作用，有待深入研究。