基于网络药理学与分子对接方法探讨黄山药干预冠心病的作用机制研究＊

但文超，刘红旭，何庆勇，娄 妍2，，蒋燕君2，，连妍洁2，＊＊

（1.中国中医科学院广安门医院 北京100053；2.北京中医药大学研究生院 北京100029；3.首都医科大学附属北京中医医院 北京100010；）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是由动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）引起管腔狭窄，导致心肌缺血、缺氧或坏死，又称缺血性心脏病，是最常见的心血管疾病之一。随着社会人口年龄结构分布的改变，冠心病发病率逐年攀升，根据《中国心血管病报告2018》概要[1]，估算我国心血管病现患人数2.9亿，其中冠心病患者数量高达1100万，居各类心脏病之首。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）评估报告表明[2]，截止2030年全球将有23.3亿人左右死于冠心病。心血管疾病，尤其是缺血性心脏病，仍然是世界范围内主要的死亡原因和长期发病率的重要原因[3]。可见，世界人群的冠心病患病率已成重大公共卫生问题。

黄山药为我国特有的薯蓣科薯蓣属植物，是国家级（五类）新药地奥心血康软胶囊（成都地奥制药集团有限公司，批号0603024，DAXXK）的主要药源。地奥心血康具有活血化瘀、行气止痛、宜痹通阳等功效，有关临床研究显示地奥心血康可缓解患者心肌缺血症状，并改善心脏血流动力学指标[4-7]，部分基础研究亦显示地奥心血康具有抗氧化损伤、抑制细胞凋亡、降低炎性因子的表达[8-10]，延长凝血酶原时间和抑制纤维蛋白[11]的作用。有Meta分析结果显示，地奥心血康胶治疗冠心病心绞痛，在单用或与常规药物联合运用的情况下，在提高总疗效、改善心电图方面具有更大的优势，且药物安全性较好[12]。研究表明[13]黄山药含有多种甾体皂苷类物质及活性多糖等有效成分，具有改善心血管功能、抗血小板聚集、降血脂等多种药理作用，但目前对于黄山药干预冠心病的药理学作用机制的研究相对匮乏。

网络药理学是运用高通量筛选、网络可视化及分析技术揭示药物、靶点、疾病之间复杂的生物网络关系，分析、预测药物的药理学机制的研究方法[14]。李梢教授等[15]利用网络药理学从生物网络调控角度对中药方剂现代研究的方证关系、病证关系和方剂的多靶点作用等问题进行了探索并取得了有意义的结果。分子对接是预测蛋白与配体亲和能力和结合模式的强有力的工具，对于给定的蛋白质和配体（蛋白质、DNA/RNA、小分子），可通过预测它们的结合模式及结合自由能，进而对其功能及作用机制进行研究。基于分子对接方法的虚拟筛选已成为针对特定靶蛋白药物研发的必备流程之一[16]。

为更好地了解黄山药干预冠心病的作用机制，本研究通过网络药理学及分子对接的方法，在分子的水平上，从化学成分、作用靶点和信号传导通路对黄山药干预冠心病的作用机制进行系统研究，以期为进一步揭示黄山药的药理作用机制提供理论基础，研究流程图见图1。

图1 研究流程图

1 材料与方法

1.1 黄山药相关成分及靶点筛选

通 过ETCM（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine）数据库[17]（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）并结合查阅文献对黄山药的化学成分信息进行收集，将收集的化学成分逐一通过Pubchem数据库[18]获得成分的分子结构图并以3Dsdf的格式存储。将所获取化合物结构输入SwissADME平台[19]（http://www.swissadme.ch/）。设置潜在核心化合物的标准为：①肠胃吸收（gatrointestinal absortion;GIabsortion）为“High”，表明成分具备良好口服生物利用度，可被吸收②设置5类药性预测（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）结 果 中 有2个 及2个 以 上 为“Yes”。其后通过文献核查根据筛选标准所排除的化合物，若化合物药理作用明显且与研究主题相关，仍予以纳入，最终获得研究主题相关的潜在化合物。再利用基于药效团匹配法的PharmMapper数据库[20]（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）获取潜在化合物的靶点，选择Normalized Fit Score（NF）≥0.9的靶点蛋白，并根据已发表的药物相关成分文献报道，补充未预测到的活性化合物的已知靶点。

1.2 冠心病相关靶点筛选

为保证数据的准确性与全面性，以“coronary heart disease”、“coronary disease”“coronary atherosclerotic heart disease”“CHD”等冠心病相关名词为关键词，搜索GeneCards数 据 库[21]（https://www.genecards.org）、DisGeNet数 据 库[22]（http://www.disgenet.org/home/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）数据库[23]（http://www.omim.org）、DRUGBANK数据库[24]（https://www.drugbank.ca/）以获得冠心病核心靶点。其中DRUGBANK数据库基于临床试验药物证据构建而成，提供了丰富的药物数据与全面的药物靶标信息。OMIM、GeneCards、DisGeNet数据库基于文献构建，各个数据库之间各有优势、相互补充。将上述数据库所获取的靶点，删除重复值后进行合并。再根据文献报道补充未预测到的活性成分的已知靶点。使用UniProt蛋白质数据库[25]（https://www.uniprot.org）将疾病靶点与药物成分的潜在靶点统一规范为Gene Symbol，其后将两者进行映射，以获得黄山药潜在干预冠心病的靶点。

1.3 黄山药成分-冠心病靶点PPI网络构建

蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）是指从生物化学，信号转导和遗传网络的角度研究化合物和疾病相关蛋白质分子之间的相关性。为阐明靶点蛋白在系统水平上的作用，将上述靶点上传至STRING11.0数据库[26]（https://string-db.org），选择物种为“智人”，设置靶点关联的置信度为0.40，以获得PPI网络关系，并通过CytoScape3.7.2软件[27]制作PPI网络图。利用CytoScape3.7.2中的MCODE插件[28]对蛋白质相互作用关系进行分析，得到潜在蛋白质功能模块并分析相关功能。

1.4 黄山药成分与冠心病靶点GO功能富集和KEGG通路富集

1.5 成分-靶点-通路网络图的构建

将“1.4”项下的交集靶点与KEGG富集出生物通路的相互作用信息与“1.2”项下筛选出的药物成分与交集靶点合并，上传到Cytoscape3.7.2中构建出药物成分-靶点-通路网络图。利用CytoScape3.7.2内置的Network Analyzer分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closenesss）等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及干预冠心病的主要活性成分。

1.6 分子对接评估

选择分析得到黄山药成分-冠心病靶点网络图中度值排名为前6的靶点。通过RCSB数据库[30]（htp://www.rcsb.org/pdb）下载靶点蛋白的三维晶体结构，并以pdb格式进行保存。将候选化合物的3D化学结构通 过Open Babel3.1.1[31]（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）转换为pdb格式文件。采用Autodock Tools1.5.6[32]（http://autodock.scripps.edu/resources/tools）进行除水、加氢，计算Gasteiger电荷，储存为pdbqt格式文件。对潜在核心成分配体进行能量最小化处理，赋予配体原子类型、计算电荷，储存为pdbqt格式。利用MOE2019[33]进行分子对接操作，以对接评分Affinity来筛选结合活性较好的活性成分与靶点，其中对接评分Affinity<-4.25 kcal·mol-1可认为配体与靶点之间具有结合活性，得分<-5.0表明结合活性较佳，得分<-7.0 kcal·mol-1两者之间有强烈的对接活性[34]。

2 结果

2.1 黄山药的主要活性成分靶点预测结果

综合查阅文献[35-39]，包括2015年版《中华人民共和国药典》（第十版）、高效液相色谱法研究、综述进展等共获得黄山药相关的30种化合物结构，其有效成分主要为甾体皂苷类物质，包括伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元、异螺甾烷醇类皂苷、呋甾烷醇类及其他类皂苷等成分，还包括少数非甾体皂苷成分，如棕榈酸。通过SwissADME筛选出11种活性最高的成分，结构见表1。利用PharmMapper预测并选择NF≥0.9的靶点，去除所有重复基因后共计139个预测靶点。

表1 黄山药11种活性最高的成分

续表

2.2 黄山药干预冠心病相关靶点获取

在Genecards数据库中得到冠心病相关作用靶点6810个，选择相关度得分Score≥20.48的靶点作为冠心病的潜在靶点，获得1703个相关靶点。结合DisGeNet、OMIM、DRUGBANK数据库补充相关靶点，除重后合并，最终得到1975个冠心病相关靶点。将黄山药有效成分的139个靶点与1975个冠心病相关靶点取交集，获得62个共同靶点，并通过R3.6.1绘制VENN图（图2）。

图2 药物靶点和疾病靶点VENN图

2.3 PPI网络构建

将62个交集靶点上传至String11.0数据库，获得PPI网络信息并利用Cytoscape 3.7.2重新构建靶蛋白PPI网络（图3）。得到PPI网络后，运用CytoScape3.7.2中的MCODE插件，对PPI网络进行进一步分析，得到潜 在Module（图4），推 测MPK1、MPK8、MPK14、PIK3R1等为主要靶点。根据P值，分别保留PPI网络与Module中3个最佳评分的生物学进程并描述其功能（表2）。

图3 黄山药-冠心病靶点PPI网络

图4 黄山药-冠心病靶点PPI网络中的Module

表2 黄山药-冠心病靶点PPI网络功能描述

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集

利用Bioconductor中ClsuterProfiler程序包对黄山药干预冠心病相关靶点进行生物信息分析（图5）。图7-A表明黄山药干预冠心病主要涉及生物学过程的对类固醇激素的反应（response to steroid hormone）、调节炎症反应（regulation of inflammatory response）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）。图7-D为KEGG通路分析结果，图中显示了黄山药干预冠心病排名前20的信号通路，关键通路包括丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、PI3K-Akt信 号 通 路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

图5 黄山药主要成分潜在靶点的富集分析

2.5 黄山药成分-靶点-通路网络的构建

运用CytoScape3.7.2构建“黄山药成分-靶点-通路”网络图，并通过其内置工具分析黄山药干预冠心病靶点网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。如图6所示，此网络由62个节点和215条边构成，红色节点代表潜在靶点，橙色节点代表黄山药中的活性成分，绿色节点代表潜在信号通路，连线代表三者之间的相互作用，图中节点面积越大、颜色越深表明其对冠心病的影响越大。

图6 黄山药干预冠心病成分-靶点-通路图

Cytoscape网络分析中，每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了黄山药内含的多种成分，可能通过多靶点干预冠心病。其中HSY-3（新甾体皂苷）度值为15，介度为0.127，紧密度为0.480，预测新甾体皂苷为黄山药干预冠心病的主要成分，其次为HSY-8（胡萝卜苷）（连接度为14，介度为0.107，紧密度为0.473），HSY-5（progeninⅢ）（连接度为8，介度为0.0446，紧密度为0.414）（表3）。MAPK1、MAPK10、MAPK8、MAP2K1、PIK3R1靶点基因的网络节点度排位靠前，连接度分别为22、16、15、15、14，预测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族为黄山药干预冠心病的核心靶点，PIK3R1、EGFR、RAC1、PRKACA、IGF1亦为相对重要的靶点（表4）。由表5可知，通路与通路之间是通过共有靶点连接而非独立分开的，表明黄山药可通过各条通路之间可发挥协同作用起到干预冠心病的作用。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对研究数据进行统计分析，计量资料以表示，数据比较采用t检验，计数资料以[例(%)]表示，数据比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表3 黄山药主要活性成分网络节点特征参数

表4 黄山药主要活性成分靶点网络节点特征参数

表5 黄山药干预冠心病靶点通路富集结果

2.6 分子对接筛选

将11种核心澘在化合物与6个核心靶点ALB（PDBID:6RQ7）、EGFR（PDBID:5GTY）、MAPK1（PDBID:1PME）、SRC（PDBID:4U5J）、IGF1（PDBID:3LVP）、CASP3（PDBID:1NMS）进行分子对接，最终得到60组受体-配体对接结果。在60组受体-配体结果中，其 中Affinity<-5 kcal·mol-1的 组 合 共 有59组，Affinity<-7 kcal·mol-1的 有30组，占50%。在 化合物-靶点网络中的组合有15个，平均值为-7.641 kcal·mol-1，其中对接得分最高的为：EGFR-新甾体皂苷（3β,26-二醇-25(R)-∆5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷），分值为-8.728kcal·mol-1，对接得分最低的为ALB-panthogenin-B，分值为-6.551 kcal·mol-1，这表明所筛选的的潜在核心化合物与核心靶点之间可能具有较好的结合活性。网外45个组合排名前三的 组 合 有：daucosterol-ALB（-9.356 kcal·mol-1），trillin-EGFR（-9.051 kcal·mol-1），daucosterol-EGFR（-8.937 kcal·mol-1）。网外组合平均值为-7.080 kcal·mol-1，分值均小于-4.25 kcal·mol-1，提示均有良好的对接活性。对接结果可为今后进一步开展相关中药及成分的实验筛选设计提供数据支撑，分子对接结果见图7，部分核心化合物对接模式见图8。

图7 分子对接结果

图8 黄山药部分核心化合物分子对接模式

3 讨论

祖国医学中虽无冠心病的病名，但古代医籍中早有其典型临床表现的记载，当属于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范畴，《素问》云：“心痹者，脉不通”。中医认为气滞、血瘀、痰浊、寒凝，以及气血阴阳的不足为主要致病因素，进而导致心脉痹阻而发病，病变于心，属本虚标实之证，活血化瘀法是治疗冠心病的重要法则[40-42]。现代临床研究表明[43]冠心病患者存在血液流变性异常，血流动力学改变，微循环障碍等病理改变，其主要病理学基础为动脉粥样硬化和血脂代谢异常。黄山药性温，味微辛，可通过扩张冠状动脉血管，减小血液黏稠度以及血小板的聚集率来改善血循环[44]，研究显示，以黄山药为主要药源的地奥心血康具活血化瘀、行气止痛、扩张冠脉血管和改善心肌缺血等功效，广泛运用于临床干预心血管疾病。

3.1 潜在有效成分分析

地奥心血康主要成分为薯蓣皂苷元（diosgenin）和伪原薯蓣皂苷（pseudoprotodioscin）[45]。薯蓣皂苷元是一种重要的甾体皂苷元，广泛存在于薯蓣科等多种植物中，杨柏等人研究发现[46]薯蓣皂苷元可抑制PARP/p53和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）表达而减轻冠心病模型猪的氧化应激和炎症反应。马海英等[47]通过实验证实薯蓣皂苷元在体外有明显的抗血小板聚集活性。薯蓣皂苷元的分子结构与雌激素类似，亦有基础实验[48]表明其能够显著上调血管内皮生长因子A（VEGF-A），这种作用是经由雌激素受体相关的PI3K/Akt通路调节的。此外，本研究通过网络药理学方法初步筛选出黄山药干预冠心病的主要活性成分尚有新甾体皂苷（3β,26-二醇-25(R)-∆5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷）、胡 萝 卜 苷(daucosterol)、延龄草苷（trillin）、panthogenin-A等。AS是导致冠心病主要危险因素，炎症反应是AS形成中的一个重要因素[49]，故降低炎症反应的作用更有利于减少AS形成，并起到保护心血管的作用。胡萝卜苷是一种广泛存在于植物中的植物甾醇糖苷，HUNG等[50]在研究胡萝卜苷的药理作用时，证实胡萝卜苷可抑制MAPK、JNK等相关炎症反应信号通路的活化。阿司匹林作为冠心病的一级预防药物[51]，具有抗血小板聚集的作用，可显著减少主要心血管事件。KOO等[52]发现胡萝卜苷抗2-5 μg·L-1胶原诱导的血小板聚集作用约为阿司匹林的2倍，证明胡萝卜苷有良好的抗血小板聚集作用。NO可通过促使氧化应激损伤、能量代谢障碍、炎症反应发展发生等加重心肌损伤。延龄草苷具有明显的抗高脂血症和抗氧化作用[53]，有研究发现[54]其能抑制NO的释放，同时减少诱导细胞死亡，降低TNF-α、IL-6、COX-2 mRNA等炎性基因的表达，并可通过上调Sirt1的表达、下调NF-Kβ和TNF-α的表达，从而提高抗氧化能力，降低炎症因子损伤[55]。除此之外，存在一些尚未被报道的有效成分亦可能为黄山药干预冠心病的主要有效成分，如3β,26-二醇-25(R)-∆5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、panthogenin-A等，预测这些有效成分的功效将成为未来研究黄山药干预冠心病的潜在方向，其药效学及作用机制有待进一步验证。

分子对接结果显示，黄山药中的核心化合物胡萝卜苷、延龄草苷、新甾体皂苷、progeninⅢ等与主要靶点（ALB、EGFR、SRC、MAPK1）的结合活性较强，这在侧面反映了网络预测结果的可靠性。故今后在设计相关基础实验或临床研究时可重点关注胡萝卜苷、延龄草苷、新甾体皂苷等在干预冠心病相关机制中的作用。

3.2 靶点分析

通过网络药理学成分筛选、靶点预测和网络分析，可发现占据网络中心位置的主要为白蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、有丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），包 括MAPK1、MAPK2、MAPK8、MAPK10等，这些靶点在黄山药干预冠心病的生物过程中可能起关键作用。既往研究表明[56]ALB减低可能是冠心病事件风险和短期死亡率增加的独立危险因素。ALB有抑制血小板活化和聚集，减少血管内皮细胞凋亡的作用，在血小板诱导冠心病的发展过程中起到调节作用[57]，与冠心病严重程度的指标呈负相关[58]；EGFR分布于所有血管上皮细胞，可通过参与RAS/RAF/MEK/MAPK，PI3K/PDK1/AKT两条主要途径发挥干预细胞生长、分化、增殖等作用，EGFR与配体（EGF）特异性结合后可促进心血管系统中ROS的形成并有助于血管收缩，李伟新等[59]研究发现EGFR可能是肥胖相关心血管疾病的治疗靶点，与心肌炎症、纤维化、凋亡和功能障碍相关；MAPKs属于酪氨酸激酶系统，在氧化应激状态下可被激活[60]。MAPK1作为炎症常用通路中的一员为重要的炎症评价指标，与炎症的严重程度有密切关系[61]，可参与冠心病的炎性反应，还可影响冠心病的脂代谢和凝血功能[62]。MAPK8是MAPK信号转导途经中重要的信号分子，当机体发生炎症反应时，能够诱导细胞凋亡，同时促进炎症因子TNF-α、IL-1β的活化[63]。

3.3 生物富集分析

通过GO功能富集分析可知，生物学进程包括对类固醇激素的反应、炎症反应调节、对营养水平的反应等，主要涉及内肽酶活性、类固醇激素受体活性、类固醇结合等方面的功能，通过KEGG富集分析可推断，黄山药干预冠心病的信号通路主要与炎症反应、免疫反应相关，例如MAPK信号通路、雌激素信号通路、Ras信号通路、PI3K/Akt信号通路等。

全身炎症是CHD的一个重要病理生理因素。在KEGG富集分析中，MAPK信号通路是富集基因最多的信号通路且与炎症反应密切相关，因此推测MAPK通路可能是通过抗炎干预冠心病的关键通路。MAPK信号通路可介导细胞产生各种反应，Logatkina等[64]发现MAPK信号通路成分的增加可导致冠心病患者全血细胞持续炎症激活。在MAPK信号通路中JUNK/p38MAPK通路是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一，与细胞炎症、凋亡、生长有关，其中p38MAPK与多种病理过程如心肌病变、心脏缺血/再灌注、动脉硬化的发生等相关[65]，激活p38MAPK信号通路可使血管平滑肌细胞从中膜进入内膜并发生增殖，促进AS的发生和发展[66]。周茜等[67]研究表明通过促进MAPK通路中ERK的活化、减少促凋亡通路中JNK和p38MAPK的激活，可减轻心肌纤维化，从而保护心肌靶器官。

基础研究显示[68-71]雌激素可通过调节凝血功能、抗炎作用及动员血管内皮细胞，并促进血管内皮细胞缺血损伤后修复来实现保护血管内皮细胞，以达到防止AS，保护心血管系统的作用。王宇等[72]研究显示雌激素主要通过与其受体结合后激活包括PKB/Akt、ERK1/2、p38-MAPK在内的信号通路，抑制内质网应激及引起的血管内皮细胞凋亡，保护心血管系统，从而防止As的发生。因此推测雌激素信号通路为黄山药发挥抗炎、保护血管的一条潜在通路。

PI3K/Akt是调节心脏功能相关的重要信号转导通路，通过调节心肌细胞凋亡、血管再生、促进细胞能量代谢等影响冠心病的发生和发展[73-75]。Ravingerova等[76]通过大鼠实验发现PI3K/Akt信号通路的级联反应对大鼠心脏具有保护机制。PI3K/Akt信号通路还可以使糖原合酶激酶-3（glycogensynthase，GSK-3）磷酸化，降低GSK-3的活性，增加心肌对葡萄糖的摄取和脂代谢能力，从而保护心脏[77]。在Ras信号转导途径中，Ras蛋白作为分子开关参与信息传递可激活下游信息传递途径如MARK信号途径、PI3K/Akt信号通路、GalGEF信号通路等，参与调节细胞代谢、凋亡、增殖和分化。由此可以推测Ras信号通路、PI3K/Akt信号通路等在黄山药干预冠心病过程中亦发挥重要作用。

综上所述，已有相关报道的和冠心病相关的生物通路主要与炎症、免疫反应相关，提示黄山药可能通过MAPK信号通路、雌激素信号通路、Ras信号通路、PI3K/Akt信号通路干预冠心病。

4 结语

本研究基于网络药理学、分子对接的研究方法，通过靶点预测、蛋白相互作用网络、GO富集分析和KEGG通路富集分析，提示黄山药主要活性成分胡萝卜苷、延龄草苷、新甾体皂苷等，可能通过ALB、EGFR、SRC、MAPKs等靶点，作用于MAPK、雌激素、Ras、PI3K/Akt等信号通路干预冠心病。需要注意的是，网络药理学是依据现有数据库和已有实验数据进行网络的建模，由于原始实验数据、图谱信息来源于不同的实验条件，故实验存在一定的假阳性率和假阴性率[78]。本文基于理论层面对黄山药干预冠心病的作用机制进行了预测分析，预测分析结果与现有数据库和实验数据不尽相同，希望本分析结果可为下一步深入研究提供新的思路，也期待更为丰富的研究结果。后续研究团队将持续关注黄山药药理研究进展，并在此基础上进一步进行动物或细胞实验，以深入探讨黄山药干预冠心病的靶点及机制。