基于网络药理学和分子对接技术探讨经典名方泻白散治疗肺炎的潜在作用机制＊

向泽栋 ，李 震 ，张 兵 ，张宏萌 ，王少平 ，张加余 ，于海涛 ，代 龙 ，高 鹏

（1.山东中医药大学药学院济南250355；2.山东省食品药品审评查验中心济南250014；3.滨州医学院药学院烟台264003；4.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司德州251200）

肺炎是一种肺部出现发炎，以咳痰、胸痛、发热及呼吸困难为常见症状的疾病。肺炎通常由细菌或病毒感染而引发，易感人群分布广泛，自幼儿至老年全年龄段均有患病可能，感染时呼吸系统及全身症状强烈，严重影响患者工作和生活，为患者家庭及社会增加严重负担[1]。2019年爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球范围内造成严重影响，人类生命健康受到威胁，世界经济受到重创，目前仍无特效药出现，再次引起人们对肺炎疾病的关注与研究热情[2]。因此，尽快研制开发对肺炎疾病安全、有效的药物至关重要。

泻白散始载于北宋时期钱乙所著《小儿药证直诀》，“治小儿肺盛，气急喘嗽”，入选2018年国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》（以下简称《目录》），是历史悠久，疗效确切，沿用至今的治疗肺热咳喘的经典名方[3]。《目录》中，泻白散全方由桑白皮、地骨皮、甘草组成，方中桑白皮甘寒性降，专入肺经，清泻肺热；地骨皮甘寒入肺，清降肺中伏火；甘草甘平，养胃和中，配伍严谨，立法周全。现代临床中，泻白散被广泛用于支气管炎、肺炎等肺部疾病[4-5]。2008年以来，经典名方新药研发“注册简化”相关政策陆续推出，符合要求的经方可免报药效学及临床研究资料，直接申报生产，但并不意味着经方的药理作用无需研究，面对现代医学高度精准、高度综合的发展潮流，古代经典名方的研究只有越深入，才能获得更高的社会认可。泻白散虽有悠久的临床应用历史，但其治疗肺炎疾病的作用机制尚不清楚，限制了泻白散的广阔应用前景。

中药具有多成分、多靶点、多作用通路的特点，对疾病起到较好治疗效果的同时，其成分分析、机制阐释却成为难点。网络药理学具有整体性、系统性的特点，通过构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络，阐明中药复杂体系的潜在作用机制，与中医药整体观、辨证论治理念相符，是推动中医药作用机制深入研究，扩大中医药临床适应症的有力工具，已被成功用于多种中药复方潜在作用机制的探索与阐明[6-7]。本文首次利用网络药理学和分子对接技术，以整体的视角阐明泻白散治疗肺炎疾病多靶点、多通路的复杂分子机制，以期为泻白散临床治疗肺炎疾病提供理论依据，为泻白散临床药方与现代制剂的一致性评价提供新的视野，促进泻白散“由方变药”的研究进程，为肺炎疾病新药研发提供借鉴与参考。

1 方法

1.1 泻白散活性成分的获取

以“地骨皮”、“桑白皮”、“甘草”为关键词，通过中药系统药理数据库及分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）和中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）提取各味中药活性成分[8-9]。TCMSP筛选条件设置为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL≥0.18）；BATMAN-TCM筛选条件设置为截止分数（Score cutoff）=20、调整后P值=0.05。

1.2 泻白散活性成分作用靶点和肺炎靶点的获取

通过TCMSP和BATMAN-TCM获取活性成分作用靶点的信息，使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）将相关蛋白靶点名称转换成基因名称。利 用DisGeNET数 据 库（https://www.disgenet.org/search）和Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）[10-11]，以Pneumonia为关键词进行检索，对两数据库靶点取交集，获取肺炎相关靶点。采用Venny 2.1工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）筛选得到泻白散活性成分与肺炎共同靶点，用Cytoscape 3.6.0软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及关键靶点筛选

将1.2中获取的共同靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/）进行蛋白互作（Protein Protein interaction,PPI）分析[12]，限定物种为“Homo Sapiens”(即人类)，选择隐藏游离靶点，设置最低互作分值（minimum required interaction score）为0.9，构建PPI网络。将获得的PPI网络数据导入Cytoscape 3.6.0软件，利用Network Analyzer插件进行拓扑学分析，以节点连接度（degree）的2倍中位数，紧密中心度（Closeness Centrality,CC）和间距中心度（Betweenness centrality,BC）的中位数为卡值，选择同时满足3个卡值的靶点作为关键靶点。

1.4 泻白散作用于肺炎的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将1.3中筛选得到的关键靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物种为“Homo Sapiens”，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，利用微生信数据分析网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）对结果进行可视化处理。

1.5 泻白散作用于肺炎的成分与核心靶点的分子对接

从Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和Chemspider数 据 库（http://www.chemspider.com/）下载泻白散活性成分的SDF格式文件，经Chem3D软件转化为Mol2格式文件，从Protein Data Bank数据库（PDB,https://www.rcsb.org/）获取PPI网络中核心靶点的3D结构的PBD格式文件（CXCL8（PDB:6N2U）；IL6（PDB:1IL6）；IL1B（PDB:5R86）；TNF（PDB:1TNF）；IL4（PDB:1BBN）；IL13（PDB:3LB6）；IL10（PDB:2H24）；NFKB1（PDB:2DBF）），导入PyMol软件去除水分子和异质分子。利用AutoDock Tools1.5.6 子对接模拟软件对蛋白质进行添加氢原子等操作，再将化学成分和靶点文件均转化为pdbqt格式的文件，运用Grid模块设置蛋白原配体为对接盒子中心，格 点 盒 子 尺 寸 大 小x×y×z设 定 为40×40×40，Spacing(angstrom)设置为1.000，导出中心格点盒子的中心x，y，z参数值。利用AutoDock Vina软件将受体（靶点）与配体（化学成分）进行半柔性对接，结合能小于0 kJ·mol-1表明受体和配体具有自发结合潜力，结合能≤-5.0 kJ·mol-1说明化学成分与靶点对接效果较好。

2 结果

2.1 泻白散活性成分及与治疗肺炎靶点预测

通过TCMSP和BATMAN-TCM，检索到有靶点信息的地骨皮活性成分14种，桑白皮活性成分39种，甘草159种，共212个活性成分和1448个靶点。通过DisGeNET和Gene Cards，检索到191个肺炎靶点。利用Venny 2.1对活性成分靶点与肺炎靶点取交集后，共得到53个共同靶点，即为泻白散治疗肺炎的潜在靶点（图1）。

图1 泻白散活性成分靶点与肺炎靶点Venn图

2.2 药物-成分-靶点-疾病网络构建

如图2所示，利用Cytoscape 3.6.0软件构泻白散治疗肺炎的“药物-成分-靶点-疾病”网络，网络中共有活性成分节点74个，靶点节点53个，节点间相互作用的边272条。按节点的度排序，排名在前的活性成分有槲皮苷、7,8-二氢-3-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-2(6H)-酮、四氢巴马汀、葫芦巴碱、血根碱、山奈酚等成分，化学成分相关信息见表1。

表1 泻白散治疗肺炎活性成分Top 10

图2 泻白散治疗肺炎的药物-成分-靶点-疾病图

2.3 PPI网络构建及关键靶点筛选

将泻白散的53个作用靶点导入STRING数据库进行PPI分析。利用Cytoscape 3.6.0软件进行处理，结果如图3，在网络中有44个节点和262条边，通过拓扑学分析，设置3个卡值degree≥10，CC≥0.4407，BC≥0.0044，选择满足以上三个卡值的节点为关键靶点，共筛选得到白细胞介素-6（IL6）、白细胞介素-6（CXCL8）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL1B）、白细胞介素-10（IL10）、核因子NF-κBp105亚基（NFKB1）、白细胞介素-4（IL4）、补体C3（C3）、白细胞介素-13（IL13）等关键靶点。将关键靶点导入STRING数据库进行PPI分析，利用Cytoscape 3.6.0软件进行处理，在网络中有9个节点和54条边，靶点相关信息见表2。

表2 泻白散治疗肺炎关键靶点

图3 泻白散治疗肺炎PPI网络及关键靶点筛选

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通过DAVID对关键靶点进行GO功能富集分析（P<0.05），共得到90个条目，其中生物过程87条，细胞组成3条，分子功能3条，按P值排序取前20条作图（图4）。泻白散治疗肺炎可能涉及炎症反应（inflammatory response）、免疫反应（immune response）、细胞因子活性（cytokine activity）、序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调节（positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、细胞对脂多糖的反应（extracellular space）等生物过程。通过DAVID对关键靶点进行KEGG通路富集分析（P<0.05），共得到41个信号通路，按P值排序取前20条作图（图5）。泻白散可能通过炎症性肠病（Inflammatory bowel disease(IBD)）、百日咳（Pertussis）、美洲锥虫病（Chagas disease(American trypanosomiasis)）、军团菌病（Legionellosis）等发挥治疗肺炎的作用。

图4 泻白散治疗肺炎关键靶点GO功能富集分析气泡图

图5 泻白散治疗肺炎关键靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.5 分子对接

利用AutoDock软件对degree前7的核心药效成分和PPI网络中degree前8的核心靶点进行分子对接模拟计算，如表5，对接结果显示，药效成分与核心靶点的最低结合能均小于0 kJ·mol-1，说明预测的成分与靶点可以自发进行结合，其中TNF蛋白、IL4蛋白与各成分的对接结合能均小于-5.0 kJ·mol-1，CXCL8蛋白、IL6蛋白、IL1B蛋白、IL13蛋白和IL10蛋白与槲皮素、四氢巴马汀、血根碱、山奈酚、β-谷甾醇的对接结合能小于-5.0 kJ·mol-1。将以上对接结果以PyMol软件进行可视化，结果部分显示如图6，可见槲皮素与TNF在ARG103，GLU116，SER-99处形成氢键，3-甲基-6,7,8-三氢吡咯并[1,2-A]嘧啶-2-酮与TNF在PRO-117形成氢键，四氢巴马汀与IL1B在SER-125处形成氢键，葫芦巴碱和TNF在TYR-119处形成氢键，血根碱和IL13在ALA-204处形成氢键，山奈酚和TNF在SER-99,GLU-116处形成氢键，β-谷甾醇和CXCL8在GLU-70,GLN-59处形成氢键。

表3 泻白散中核心活性成分与核心靶点分子对接结果

图6 泻白散成分与核心靶点分子对接结果（部分）。

3 讨论

3.1 泻白散治疗肺炎主要成分分析

通过对泻白散治疗肺炎的网络药理学研究发现，泻白散中有74个活性成分通过53个靶点对肺炎发挥治疗作用，主要为3-甲基-6,7,8-三氢吡咯并[1,2-A]嘧啶-2-酮、四氢巴马丁汀、葫芦巴碱、血根碱等生物碱类，槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素等黄酮类成分。分子对接结果显示槲皮素、血根碱、山奈酚、β-谷甾醇等与核心靶点IL8,IL6,IL4和TNF等均能实现自发结合，可能在治疗肺炎过程中起到重要作用。槲皮素通过增强细胞活力，抑制细胞凋亡和减少炎性细胞因子IL6和TNF-α的产生，可以减轻肺成纤维细胞炎症损伤[13]。脂质体槲皮素可以显著降低支气管肺泡中TNF-α，IL1B和IL6的表达水平，并明显减轻肺纤维化区域和胶原蛋白沉积，表明槲皮素可以通过抑制炎症细胞因子水平减轻博来霉素诱导的肺纤维化[14]。β谷甾醇可有效防止肺炎链球菌溶血素引起的细胞裂解[15]，同时能够抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肺泡上皮细胞慢性损伤，起到抗肺纤维化作用[16]。β谷甾醇具有抗炎作用，能够抑制肺泡上皮细胞凋亡，对流感病毒引起的肺炎和急性肺损伤具有较好疗效[17]。山奈酚能够显著降低急性肺损伤小鼠模型的肺水肿程度，降低血浆和肺组织中炎性细胞因子IL6，IL1B和TNF-α的水平[18]。血根碱可显著降低髓样细胞触发性受体的表达，通过抑制NF-кB核易位，减轻肺炎支原体感染的A549人肺上皮细胞的炎症反应[19]。本研究对泻白散治疗肺炎疾病活性成分的预测存在一定事实依据和文献支持，预测结果具有现实指导意义。

3.2 泻白散治疗肺炎关键靶点分析

白细胞介素8（CXCL8或IL8）主要由单核-巨噬细胞产生，其氨基酸顺序与多种炎症因子有较高相似性，CXCL8的主要生物学活性是吸引和激活中性粒细胞，使中性粒细胞发生形态变化，定向游走到反应部位释放活性产物，进而导致机体局部炎症反应[20]。Chen等[21]提出在体外肺炎支原体以时间依赖的方式诱导支气管上皮细胞产生CXCL8，使中性粒细胞活性明显增加，推测肺炎支原体/CXCL8/中性粒细胞轴可能是肺炎支原体肺炎重要发病机制。白细胞介素6（IL6）作为促炎性细胞因子，可以刺激多种疾病的炎症过程，如糖尿病，类风湿性关节炎，多发性硬化症等[22]。细胞因子风暴是COVID-19重症反应的重要部分，Zhang等[23]报道IL6在细胞因子释放综合征中起重要作用，推测阻断IL6的信号转导途径可能成为治疗重症COVID-19患者的方法。白细胞介素1β（IL1B）是由炎症小体受体NLRP3突变而产生的一种细胞因子，介导了多种自身炎症综合症[24]。Gharebaghi等[25]报道通过降低IL1B表达水平，可以减轻COVID-19感染的病理表现。肿瘤坏死因子（TNF）主要由活化的巨噬细胞产生，能够促进炎症反应，引起类风湿性关节炎、炎症性肠病等多种自身免疫性疾病[26]。Del Valle等[27]提出IL6和TNF-α血清水平是COVID-19疾病严重程度和死亡的重要预测指标，并在患者中得到验证。可见，本研究预测的泻白散治疗肺炎疾病的关键靶点与诸多文献报道具有一定的相似性，侧面印证了研究结果的重要意义。

3.3 泻白散治疗肺炎关键靶点的GO功能富集分析

炎症反应是机体对化学或物理因素引起的感染或伤害的直接防御反应，其特征为局部血管扩张、血浆深入细胞间质以及白细胞和巨噬细胞的积累。肺炎是指肺部受到病毒或细菌感染而出现发炎的症状[28]，关键靶点的生物过程分析集中于炎症反应，为泻白散治疗肺炎提供了理论依据。免疫反应是指任何在生物体对潜在的内部或侵入性威胁做出调整反应时起作用的免疫系统过程[29]。Felsenstein等[30]提出新型冠状病毒SARS-CoV2可以导致细胞死亡，并将病毒和细胞内成分释放至细胞外，导致免疫细胞的富集、免疫复合物的产生，导致疾病后期的大量炎症反应。Quinton等[31]认为肺炎发病和发展的过程取决于机体免疫力的保护能力和炎症的损害程度，同时肺外组织（肝脏、骨髓等其他组织）的反应对机体抵御肺炎的侵袭至关重要，提示肺炎不只是单纯肺部急性感染，而是由机体多种生理系统参与并相互作用的复杂病症。细胞因子活性是指与受体发生相互作用以影响受体活性的细胞因子的活性，能够控制组织和细胞的存活、生长、分化和功能[32]。Zbinden-Foncea等[33]提出严重COVID-19患者经历了细胞因子风暴综合征，IL6、IL10和TNF-α等细胞因子表达水平的激增对肺炎病情的加深有重要影响。因此，泻白散可能通过介导和调节机体炎症反应、免疫反应、细胞因子活性等实现对肺炎疾病的治疗。

3.4 泻白散治疗肺炎关键靶点的KEGG通路富集分析

Mateer等[34]指出炎症性肠病的常见并发症为支气管扩张、慢性支气管炎等肺部疾病，推测功能失调的免疫细胞归巢、全身性炎症和肠道微生物失调等为炎症性肠病诱导的肺炎的发病机制。Xu等[35]提出肺炎是百日咳的并发症，在男性幼儿的百日咳病程的前两周内易发生肺炎。Paddock等[36]对百日咳患者的肺组织病理学检查表明白细胞明显增多，且多在小肺动脉、静脉和淋巴管中聚集，提示百日咳对肺炎的发生发展有重要影响。军团菌通过感染机体肺泡巨噬细胞，破坏肺部细胞信号转导途径，导致严重的肺炎[37]。因此，泻白散可能通过参与炎症性肠病、百日咳、军团菌病等多种通路，到达治疗肺炎疾病的目的。

综上，本研究首次基于网络药理学和分子对接技术，构建了“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络，探讨了泻白散治疗肺炎疾病的作用机制，结果表明泻白散治疗肺炎疾病的活性成分可能有槲皮素、血根碱、山奈酚、β-谷甾醇等，它们可能作用于白细胞介素8（IL8）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素1β（IL1B）、肿瘤坏死因子（TNF）等靶点，通过调节炎症反应、免疫应答、细胞因子活性等过程，参与炎症性肠病、百日咳等通路，对肺炎起到治疗作用。本文为中医经典名方的复杂分子机制研究提供网络药理学和分子对接研究思路，为从整体观出发阐明泻白散治疗肺炎疾病的药效物质基础和作用机制提供参考，为经典名方与现代制剂的一致性评价提供作用机制的研究方法，但本研究的部分预测结果仍需进一步通过细胞、动物实验验证，以完善相关机制研究，从而推动经典名方泻白散新药研发和应用进程。