中脑腹侧被盖区多巴胺转运蛋白的变化对老年大鼠术后认知功能的影响

许珂,郭佳,葛明月,殷姜文,殷洁婷,张晗,李燕*

(1 石河子大学医学院,新疆 石河子 832002;2 石河子大学医学院第一附属医院,新疆 石河子 832002)

围术期神经认知障碍(Perioperative neurocognitive disorders,PND)的发病机制是多种因素的协同作用,迄今为止,确切机制尚不明确[1]。有研究报道,α-synuclein(α-syn)、β-Amyloid1-42(Aβ1-42)的过度表达可抑制多巴胺能神经元神经递质释放,这可能是术后3个月内PND的预测因素[2],并且选择性使中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA)多巴胺神经元变性可导致海马多巴胺流出量降低[3-4]。而多巴胺(Dopamine,DA)的细胞外浓度主要依靠多巴胺转运蛋白(Dopamine transporter,DAT)进行调控[5],因此本研究旨在观察中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺转运蛋白(DAT)的变化对老年大鼠术后认知功能的影响,并初步探讨VTA区DAT变化对老年大鼠术后认知功能的影响是否与调控海马区α-syn、Aβ1-42蛋白聚集有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性,清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠50只,18～20月龄,体质量300～500 g(石河子大学医学院动物实验中心提供)。饲养环境:大鼠自由活动、摄食、饮水,室温21～23 ℃,相对湿度为45～55%。采用随机数字表法分为5组,每组10只:空白组(Normal,N)、假手术组(sham,S)、PND模型组(PND,P)、AAV·DAT·RNAi(AAV)、AAV·NC(NC)。

1.2 老年大鼠PND模型建立

各组大鼠术前禁食12 h,自由饮水至术前2 h。P组大鼠尾静脉注射丙泊酚20 mg·kg-1诱导待翻正反射消失后,调整为11 mg·kg-1·h-1持续输注。腹部备皮,仰卧位固定于大鼠恒温手术台,手术切口处使用碘伏消毒三次,铺无菌洞巾。定位左肋缘下,于上腹部行纵切口约2 cm,逐层进入腹腔游离脾脏,用丝线结扎脾动、静脉两次,完整摘除脾脏。检查无出血及渗血后切口用丝线按腹膜,肌肉,皮肤逐层缝合后停止丙泊酚输注,术毕给予5 mg·kg-1酮洛芬皮下注射。S组仅输注丙泊酚,不行脾切除手术。为了保证实验条件的一致性,所有手术均由同一操作者在20 min内完成。术毕待大鼠翻正反射恢复后各自放回笼饲养。

1.3 VTA区AAV·DAT·RNAi立体定位注射

构建slc6a3基因敲低DAT的腺相关病毒,AAV组、NC组大鼠在大鼠面罩吸入异氟醚麻醉下通过耳杆和齿栓将大鼠头部固定于脑立体定位仪上,用变温毯维持大鼠核心体温于37 ℃～38 ℃范围内。根据《大鼠脑图谱》的VTA坐标:AP ±5.8～6.0 mm,L/R 0.5～1 mm,H 6.5～7.5 mm定位VTA核团。使用牙科钻在大鼠颅骨表面钻孔,注意勿伤及大脑皮层。用干净棉球清除颅骨表面的骨屑,以及孔内溢出的脑脊液、血液,持细针在外科显微镜直视下轻轻挑破脑膜后,利用微量注射针在VTA核团以1 μL·min-1的速度注入AAV·DAT·RNAi/AAV·NC,注射完毕后停留10 min,待药物完全扩散并防止药物溢出,再缓慢移除注射针,缝皮。术毕连续3 d肌肉注射青霉素20U预防感染。

待其从麻醉状态下安全苏醒,放入单独鼠笼内饲养并恢复14 d后进行后续实验。

1.4 行为学评价

1.4.1 Morris水迷宫实验

术前5 d,每天将各组大鼠随机从2个不同象限放入池中2次,记录大鼠在池中找到隐藏平台的时间(逃避潜伏期,latency),使大鼠对隐藏平台的位置形成空间记忆。在第6 d,进行大鼠脾切除手术。术后第3 d分别测试大鼠对原平台的记忆能力即空间探索实验。测试时将原有平台撤除,将大鼠由原平台象限的对侧放入水中。大鼠在目标象限停留时间,穿过原平台位置的次数以及逃避潜伏期作为本实验参考记忆的主要检测指标。

1.4.2 条件恐惧实验

动物在恐惧条件下,全身除呼吸运动外其他运动全部停止的状态,记为凝滞状态(Freezing)。

在实验过程中,将凝滞时间与测试总时间百分比(即凝滞时间百分比,Freezing%)作为观察指标,衡量大鼠的恐惧记忆能力。术前1 d,将各组大鼠放入实验箱中适应60 s,然后给予一个持续30 s,90 dB的声音,声音结束前的最后2 s给予2 s,0.85 mA的足底电击,每组刺激间隔时间60 s。总训练时间330 s,共给予大鼠三组声音和电击组成的成对刺激。大鼠在实验箱休息60 s后取出,放回饲养笼内。术后3 d将各组大鼠置于与训练阶段相同的场景中,不给予声音和电击,观察并记录330 s内大鼠Freezing%,即为场景恐惧记忆测试(contextual test)。

1.5 DAT、α-syn、Aβ1-42蛋白免疫荧光

各组大鼠在体实验结束后,用4%多聚甲醛固定液经心脏实施灌注取脑,制备石蜡切片。取含VTA核团和海马的脑片用65 ℃烤箱烤片3 h后进行脱蜡,随后置于枸橼酸修复液中以低、中、高温分别修复4 min。PBS震荡清洗5 min×3次,3%Triton X-100破膜30 min后用5%BSA封闭1 h。分别滴加DAT、α-syn和Aβ1-42一抗4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后,分别滴加相应的荧光二抗,湿盒避光室温孵育2 h,PBS洗涤完成后在暗室中用0.5 μg·mL-1的PI溶液染细胞核15 min,封片后在显微镜下观察。每张切片在200×视野下随机选3个不同视野进行采图。用ImageJ图像分析系统进行荧光强度测定。

1.6 Western-Blot检测目标蛋白的表达量

各组大鼠在深麻醉下快速断头取脑,分离出海马组织。用冰冻RIPA裂解液裂解蛋白质,进行海马组织α-syn和Aβ1-42蛋白提取。聚丙烯酰胺凝聚电泳,湿转法转膜,5%脱脂牛奶室温下封闭2 h,一抗孵育后荧光素结合的二抗孵育,Bio-Rad成像仪成像,Image Lab软件分析条带灰度值。

1.7 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差(±S)表示。组间比较采用单因素方差分析,非正态分布计量资料采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VTA区立体定位脑内注射AAV·DAT·RNAi结果

2.1.1 病毒转染

VTA区AAV·DAT·RNAi病毒转染成功,显示红色荧光(mcCherry)见图1。

图1 VTA区多巴胺转运蛋白病毒转染情况

2.1.2 蛋白免疫荧光

VTA区病毒转染后多巴胺转运蛋白免疫荧光见图2。

图2 VTA区N组与AAV组多巴胺转运蛋白免疫荧光

2.2 Morris水迷宫实验

定位航行训练重复测量统计结果显示,术前5天各组大鼠泳速度及对固定平台的学习记忆能力差异无统计学意义。空间探索实验结果显示,各组大鼠游泳速度无显著差异P＞0.05(图4A),提示手术创伤和药物注射均未对大鼠的运动能力造成明显影响。空间探索实验参考记忆检测结果显示,与模型组比较,VTA区多巴胺转运蛋白敲低改善了丙泊酚麻醉手术后3 d穿台次数的减少P＜0.05(图4B),与模型组比较,VTA区多巴胺转运蛋白敲低大鼠术后3 d在目标象限停留时间明显延长P＜0.05(图4C)。与模型组相比,VTA区多巴胺转运蛋白敲低大鼠术后3 d逃避潜伏期明显缩短P＜0.05(图4D)。

图3 Morris水迷宫定位巡航训练轨迹图

图4 Morris水迷宫实验

2.3 条件恐惧实验

条件恐惧训练结果显示,各组大鼠学习探索能力基本一致,大鼠凝滞时间百分比差异无明显统计学意义。场景恐惧记忆检测结果显示,与N组相比,P组术后3 d大鼠的凝滞时间百分比明显降低P＜0.05;与P组相比,AAV组明显改善了大鼠术后3 d场景恐惧记忆损害P＜0.05(图5)。

图5 各组大鼠场景恐惧记忆损害凝滞时间百分比

2.4 海马α-syn的免疫荧光结果

免疫荧光结果显示α-syn集中表达在海马CA1区的神经元胞浆中,与N组比较,P组术后3 d海马α-syn蛋白含量明显升高P＜0.05(图6),表明丙泊酚全麻脾切除手术使老年大鼠海马CA1区α-syn蛋白聚集增多;与P组相比,AAV组海马α-syn蛋白含量明显降低P＜0.05(图6),表明特异性的敲低VTA区DAT可以使海马CA1区α-syn蛋白较术后聚集减少。

图6 海马区α-syn蛋白免疫荧光

2.5 海马Aβ1-42的免疫荧光结果

与N组相比,P组术后3 dAβ1-42蛋白含量明显升高P＜0.05(图7),表明丙泊酚全麻脾切除手术使老年大鼠海马CA1区Aβ1-42蛋白聚集增多;与P组相比,AAV组Aβ1-42蛋白含量明显降低P＜0.05(图7),表明特异性的敲低VTA区DAT可以使海马CA1区Aβ1-42蛋白较术后聚集减少。

图7 海马区Aβ1-42蛋白免疫荧光

2.6 海马α-syn、Aβ1-42的蛋白含量

与N组相比,P组α-syn含量明显升高P＜0.05(图8A),与P组相比,AAV组α-syn含量明显降低P＜0.05(图8A);与N组相比,P组Aβ1-42含量明显升高P＜0.05(图8B),与P组相比,AAV组Aβ1-42含量明显降低P＜0.05(图8B)。

图8 海马区α-syn、Aβ1-42蛋白含量的比较

3 讨论

围术期神经认知障碍(PND)多发生于接受大手术或急诊手术的患者,被认为是麻醉手术等外界因素诱发了疾病,同时多因素相互影响,相互作用,是老年人术后常见并发症之一[6-7]。PND主要是指患者在手术前后出现的海马依赖性认知功能的下降,包括记忆,意识和注意力障碍,以及人格的改变[8]。越来越多的证据表明,PND的发生在早期阶段涉及海马的神经元损伤[9],目前还不清楚是如何通过调控海马区的神经递质而导致认知能力的下降。

大脑中多巴胺通路是目前研究证明参与认知功能机制的通路之一。研究[10]表明,脑内重要神经递质多巴胺(DA)在调控情绪、觉醒、运动、认知、学习记忆、奖赏等行为方面具有至关重要的作用。DA作为中枢神经系统内与学习记忆及认知过程相关的重要神经递质,主要分布于中脑的黑质致密区(SNc)和腹侧被盖区(VTA)[11]。Ventre等[12]在使用多巴胺替代治疗和使用深部脑刺激治疗的帕金森病人中研究发现,DA具有促进记忆保持的作用,场景记忆需要DA参与,阻断DA能神经元的突触传递能够抑制视觉空间刺激引起学习记忆形成的过程。神经系统中在空间和时间上多巴胺水平的维持主要依靠多巴胺转运蛋白(DAT)。DAT能控制多巴胺的细胞外浓度,起到维持多巴胺平衡和调节神经递质信号强度的作用,DAT的数量越多,突触前膜重摄取多巴胺的能力越强。DAT功能异常会引起多巴胺系统的平衡紊乱,进而引起相关的神经系统的疾病,例如,抑郁、注意力缺陷多动症、认知功能障碍等。基础和临床的实验已经证明,应用转运蛋白抑制剂减少神经递质的再摄取来增加中枢突触间隙内的神经递质含量对于治疗神经系统疾病有效[13]。并且在以中枢神经系统疾病为特质的老年认知功能下降如:阿尔兹海默病、帕金森病等的研究中发现,这些疾病是以α-syn、Aβ1-42异常聚集发生协同作用加重突触损害为病理特点,对中枢神经元细胞产生毒性,最终发展为认知功能障碍,使用Aβ1-42寡聚体孵育海马神经元,也可导致神经元树突棘形态改变,密度下降[14]。因此,Aβ1-42和α-syn的异常聚集成为认知障碍的关键因素。而通过抑制患者脑内α-syn 寡聚体的形成,减轻其与Aβ1-42 寡聚体的协同作用从而减轻术后认知功能障碍发生的研究目前还未涉及。

在本研究中利用行为学实验观察丙泊酚麻醉脾切除手术对老年大鼠手术后认知功能的影响,建立了老年大鼠PND模型,在此基础上,我们发现通过敲低VTA区多巴胺转运蛋白,进而抑制海马区αsyn、Aβ1-42寡聚体的形成,可以改善老年大鼠的认知功能障碍,这表明海马区α-syn、Aβ1-42寡聚体的形成可能与VTA区DAT相关,通过改变DAT能够影响老年大鼠的认知功能。

本研究通过一个PND动物模型探讨海马区αsyn、Aβ1-42寡聚体的形成是否参与了手术诱导的认知功能障碍。得到结果显示,在行为学测试中利用评价大鼠学习记忆能力的经典Morris水迷宫实验,我们发现在术前训练阶段各组大鼠逃避潜伏期差异无统计学意义,说明术前各组大鼠的学习记忆能力无组间差异,而在丙泊酚全身麻醉下行脾切除手术的老年大鼠,逃避潜伏期明显延长,在空间探索实验中表现出记忆能力显著下降,这提示术后3 d老年大鼠的空间学习和记忆能力受到了损害,通过敲低VTA区多巴胺转运蛋白后与模型组相比,逃避潜伏期显著缩短,提示多巴胺转运蛋白参与了老年大鼠认知功能障碍。条件恐惧实验通过凝滞时间百分比评估大鼠情绪学习记忆(恐惧记忆)的形成能力。本研究结果显示,与空白组相比,模型组术后3 d的场景相关凝滞时间百分比显著降低,提示丙泊酚全麻脾切除手术对老年大鼠的恐惧记忆产生了影响,而通过敲低VTA区多巴胺转运蛋白可以改善这一损害。通过免疫荧光结果发现,与空白组相比,术后大鼠海马CA1区α-syn、Aβ1-42阳性细胞荧光强度均明显增高,而多巴胺转运蛋白敲低组与手术组相比,海马CA1区α-syn、Aβ1-42阳性细胞荧光强度均表现出明显的降低,进一步说明,我们使用AAV·DAT·RNAi特异性的敲低VTA区多巴胺转运蛋白后能有效的减轻手术引起的认知功能障碍,并且手术引起的认知功能障碍与海马区α-syn、Aβ1-42寡聚体的形成有一定的关系。利用Western-Blot检测海马α-syn、Aβ1-42的蛋白含量示术后海马区α-syn、Aβ1-42蛋白含量较术前显著增多,而敲低VTA区多巴胺转运蛋白后,α-syn、Aβ1-42蛋白含量表现出明显的下降,这就表明VTA区DAT变化对老年大鼠术后认知功能的影响与调控海马区αsyn、Aβ1-42蛋白聚集相关。

综上所述,VTA区多巴胺转运蛋白参与了老年大鼠丙泊酚全身麻醉脾切除手术后认知功能障碍,并且VTA区DAT变化对老年大鼠术后认知功能的影响可能与调控海马区α-syn、Aβ1-42蛋白聚集有关,进一步阐明多巴胺转运蛋白表达变化与α-syn、Aβ1-42蛋白聚集的关系,为寻找临床实用型治疗术后认知功能障碍提供重要实验依据和理论佐证。