淫羊藿苷治疗支气管哮喘作用机制的网络药理学研究*

李竹英 陈 璐 王丽洁， 王 珏△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

支气管哮喘（简称哮喘）临床表现为反复发作的喘息、气短、胸闷或咳嗽等症状，以气道慢性炎症，气道高反应性和气道重塑为主要特征，因其不断增长的发病率和死亡率而备受世界关注。中国肺健康研究显示，目前我国哮喘患病人数约4 570万，总体发病率达4.2%［1］。我国哮喘患者对疾病的认知水平普遍较低，导致全国范围内哮喘控制水平仍低于发达国家，尚未达到全球哮喘防治倡议（GINA）中设定的目标［2］。因此，如何坚持长期管理、合理规范化的治疗、有效地改善哮喘控制现状、预防未来风险的发生成为我们目前急需解决的问题。西医治疗哮喘的常用药物为糖皮质激素，虽然其具有较强的抗炎作用，但是长期服用会造成口咽念珠菌感染、声音嘶哑等副作用，给患者带来了较大的心理负担。哮喘归属中医学“哮病”范畴。中药治疗哮喘具有药性温和、药效持久、副作用小、成本低廉等优势，可明显改善患者临床症状，提高患者的生活质量。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，可以通过诱导嗜酸性粒细胞凋亡、调节Th1/Th2细胞分化和Th17/Treg细胞功能、促进炎症细胞因子及趋化因子受体释放等多种途径干预哮喘的发生［3-6］。本课题组前期研究发现淫羊藿苷可以调控Smad和MAPK信号通路减轻哮喘气道上皮间质转化［7］、抑制NF-κB和STAT3的表达、改善哮喘气道炎症和气道重塑［8］。以上研究表明淫羊藿苷治疗哮喘的疗效比较确切，但多从单一成分或单一靶点进行探讨，其具体的分子作用机制研究相对匮乏。本研究基于网络药理学方法，探究淫羊藿苷治疗哮喘的作用靶点和相关通路，为淫羊藿苷治疗哮喘的分子机制的阐明提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 淫羊藿苷的靶点预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索“Icariin”，可获得淫羊藿苷的分子结构和ADME相关参数。将淫羊藿苷的分子结构保存为mol2格式文件上传至PharmMapper数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）进行靶点预测，将Select Target Set设置为 Human Protein Target Only，选取 Z′-score＞0的结果作为淫羊藿苷的靶点。利用蛋白质数据库（Uniprot，http//www.Unitprot.org/）中的 Uniprot KB 检索功能，将靶点蛋白名转换为基因名，重复靶点仅保留1个，所得靶点即为淫羊藿苷的预测靶点。

1.2 哮喘相关靶点的获取 以“asthma”为检索词从Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）网络平台库中检索哮喘的相关靶点。同时将淫羊藿苷的预测靶点与哮喘的相关靶点在Venny 2.1.0中映射筛选出共同靶点，即为淫羊藿苷作用于哮喘的潜在靶点。

1.3 蛋白相互作用（PPI）网络的构建 将“1.2”中获取的潜在靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），获取PPI数据，将PPI数据导入Cytoscape 3.7.0中构建交集蛋白相互作用网络图。

1.4 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组数据库（KEGG）通路富集分析 运用Bioconductor生物信息软件包（http：//www.bioconductor.org/）将淫羊藿苷作用于哮喘的潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通过R语言中“Cluster profiler”进行可视化处理，设定阈值P＜0.05为指标进行筛选，选取P值前20条目制图。GO功能富集分析可以了解靶点主要的作用过程，KEGG通路富集分析可以观察靶点在通路中的分布情况。

2 结果

2.1 淫羊藿苷的靶点筛选结果 通过TCMSP检索淫羊藿苷的OB和DL值分别为41.58%和0.61，符合文献中化合物的筛选原则［9-10］，表明淫羊藿苷的成药性良好。通过Pharm Mapper数据库对淫羊藿苷进行靶点预测，得到排名前300的靶点，选取Z′-score＞0的靶点导入Uniprot数据库进行基因标准化，删除重复项，共得到淫羊藿苷的预测靶点204个，其中排名前50的靶点见表1。

表1 淫羊藿苷的预测靶点

2.2 哮喘相关靶点的获取结果 在Genecards数据库中搜索到哮喘相关靶点5 973个，将204个淫羊藿苷的预测靶点与哮喘相关靶点进行映射，取二者交集得到共同靶点125个，见图1。

图1 淫羊藿苷的预测靶点与哮喘相关靶点韦恩图

2.3 PPI网络构建结果 为进一步研究淫羊藿苷治疗哮喘的作用机制，将映射所得125个共同靶点进行PPI网络分析，将得到的PPI数据上传至Cytoscape 3.7.0软件进行可视化处理，网络图中包括125个节点、771条边，图中节点大小和颜色表示靶点degree的值，节点越大，颜色由蓝色到紫色，表示靶点的度值越大，反之表示越小，见图2。蛋白激酶B1（Akt1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、Ras同源基因家族成员A（RhoA）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的degree值排名靠前，可能是淫羊藿苷发挥中医临床功效以及与哮喘产生关联的关键作用靶点。

图2 淫羊藿苷和哮喘共同靶点PPI网络图

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

将上述125个潜在靶点经R语言运行后可得到GO功能富集分析（P＜0.05）110个条目，按照P值从小到大顺序排列，排名前20的GO条目绘制成气泡图，气泡节点越大则富集基因数目越多，颜色越红则富集越显著。如图3所示，蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、细胞因子受体结合、核受体活性、激活转录因子结合等方面靶点富集较集中。结果提示淫羊藿苷可以调控多种生物学途径防治哮喘。

图3 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析筛选得到113条（P＜0.05）通路，按照P值从小到大顺序排列，排名前20的通路绘制成柱状图，柱状图长度越长则富集基因数目越多，颜色越红则富集越显著，见图4。我们得到淫羊藿苷治疗哮喘的主要信号通路为T细胞受体信号通路、FoxO信号通路、Relaxin信号通路和VEGF信号通路。

图4 KEGG通路富集分析

3 讨 论

本研究基于网络药理学的方法，借助相关数据库与软件对淫羊藿苷治疗哮喘的作用机制进行探讨，得出了淫羊藿苷治疗哮喘的潜在靶点125个。PPI网络显示淫羊藿苷治疗哮喘的各靶点之间关系密切，其中degree值前5位的靶点依次为Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2，可能为淫羊藿苷发挥中医临床功效以及与哮喘产生关联的关键作用靶点。Akt可以通过多种途径参与哮喘的发病过程。研究发现，Akt可以通过调控中性粒细胞凋亡、氧化-抗氧化失衡、Th细胞的分化和细胞因子的产生调节哮喘的气道炎症反应［11-13］。Akt可以通过调节上皮细胞间充质转化及上调VEGF的表达促使血管再生来参与哮喘气道重塑［14-15］。此外，若Akt去磷酸化可以抑制气道的高反应性，其机制可能与其减少HIF-α的表达有关［16］。MMP-9、MMP-2可以通过降解以Ⅳ型胶原为主的细胞外基质和血管中的胶原成分，诱导气道平滑肌细胞增殖、分化、迁移至气道壁和血管外，增加平滑肌肌层厚度和促进新血管形成，引发哮喘气道重塑［17-18］。MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一。MAPK信号通路可以通过介导炎症、免疫应答、气道结构细胞反应等途径参与哮喘的发生和发展［19］。RhoA是Rho/Rock信号通路的关键受体调节型蛋白，活化后的RhoA可以激活下游效应物Rock作用于气道平滑肌细胞，调节细胞因子和炎性因子等产生，增加气道平滑肌的收缩力，在哮喘的气道重塑和气道高反应性的形成和发展中起关键作用［20］。由此可见，淫羊藿苷的关键靶点主要通过减轻炎症反应、改善气道重塑、抑制气道高反应性等多方面发挥治疗哮喘的作用。

GO功能富集分析发现，淫羊藿苷治疗哮喘的潜在靶点主要涉及细胞因子、转录因子的活性及受体结合、抗氧化应激、激素调节、蛋白质活性和酶活性等生物学功能。通过KEGG富集分析发现淫羊藿苷可以通过调控多条信号通路达到治疗哮喘的目的，其中与T细胞受体信号通路的关系最为密切，如图5所示。哮喘是以Th2免疫反应为主的慢性气道炎症性疾病。Th2细胞的增殖分化主要通过共刺激分子结合T细胞受体所介导的信号途径来完成［21］。T细胞受体作为抗原识别和免疫反应的核心，可以通过多种形式参与T细胞活化，在哮喘的发病过程中发挥着重要作用。研究显示，T细胞表面的TCR-CD3复合物与树突细胞表面的MHC复合物可以发生特异性的结合，释放抗原识别信号激活初始T细胞，使之增殖分化，从而导致哮喘的发生［22］。CD40L可以调节CD4+T细胞与B细胞之间的免疫应答，同时激活抗原递呈细胞，被认为是哮喘发病途径的关键所在［23］。CD28能够促进Th2细胞因子的释放和募集嗜酸性粒细胞聚集引发哮喘气道炎症［24］。ICOS通过T细胞受体信号的诱导，高表达于活化后的T细胞上，而ICOS的效应T细胞可以促进抗原特异性IgE的生成参与哮喘的过敏反应［25］。PD-1和CTLA-4主要表达于活化的T细胞表面，参与免疫应答的负向调控。PD-1的主要配体PDL-1和PDL-2分别通过抑制Th1和Th2细胞介导的炎症反应调控哮喘气道的反应性［26］。研究显示，哮喘患者普遍存在CD4+/CD8+失衡的免疫功能紊乱现象，且与肺功能呈现一定的相关性［27］。姜春燕等［28］研究发现，FoxO信号通路通过调控巨噬细胞M2极化和Th2免疫应答参与哮喘的炎症反应。韩曙光［29］研究显示，松弛素（Relaxin）可以通过降低细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达，抑制气道平滑肌细胞的增殖力，延缓哮喘小鼠气道重塑进程。VEGF信号通路可以通过刺激血管内皮细胞增殖，促进气道血管扩张和通透性增强，促使支气管周围纤维化等方式调控哮喘气道重塑［30］。以上的研究结果与本文的网络药理学预测结果较为一致，进一步印证了淫羊藿苷治疗哮喘的作用机制。

图5 T细胞受体信号通路

综上所述，淫羊藿苷可通过多靶点、多通路发挥对哮喘的治疗作用。淫羊藿苷通过调控T细胞受体信号通路、FoxO信号通路、Relaxin信号通路和VEGF信号通路作用于Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2等靶点，对哮喘所引发的炎症反应、气道高反应性及气道重塑发挥治疗作用。鉴于本文仅是通过数据挖掘的形式对淫羊藿苷治疗哮喘的作用机制进行预测，故存在一定的局限性，后期还需要更加深入的基础实验和临床试验予以佐证。