青光眼滤过泡瘢痕化过程中转化生长因子-β的临床作用分析

陆艳 王敏 曹西友

青光眼是临床上常见的眼科疾病之一，临床表现为眼压持续或间断升高，当超过眼球承受能力后，出现视神经萎缩及视野缺损，严重时可致失明[1]。青光眼治疗的主要目的是降低眼压，包括药物、激光及手术3种方法[2]。药物治疗目前仍存在不少并发症，且需长期坚持用药，治疗效果依赖于患者的用药依从性；激光治疗对于大多数青光眼患者只有短期疗效，效果不佳；青光眼滤过性手术仍是目前临床治疗青光眼的重要手段，可有效降低患者眼压，但术后患者滤过区组织易发生纤维组织增生、瘢痕化等，导致手术失败[3]。有学者指出，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在瘢痕化形成中发挥着重要作用[4]，为此本文就转化生长因子-β在青光眼滤过泡瘢痕化过程中转临床作用展开相关研究，报告如下。

资料与方法

一、 实验动物与分组

选取64只成年健康雄性SD大鼠，重量(250～350)g，平均重量(305.72±28.65)g，随机等分为A、B、C、D、E、F、G、H组，每组8只。所有SD大鼠入组前双眼均经过检查(裂隙灯及直接检眼镜)，所有SD大鼠双眼均正常。A组为对照组，不做任何处理，B-H组建立右眼球结膜滤过泡模型，术后观测滤过泡形成情况并监测眼压，剪取B-G组SD大鼠滤过术区结膜及结膜下组织进行Western印迹法检测。

二、制备模型

所有入组SD大鼠饲养1周后，实验眼(均为右眼)行前房引流管植入术，建立大鼠球结膜滤过泡模型，具体步骤如下[5，6]：取10%水合氯醛(陕西圣瑞医药科技有限公司，国药准字H37022673)，按照0.3 ml/100 g的剂量缓慢注射大鼠腹腔诱导麻醉，在此基础上给予大鼠右眼0.4%盐酸奥布卡因滴眼液(山东博士伦福瑞达制药有限公司，国药准字H20056587)表面麻醉，对术眼进行消毒冲洗后铺上无菌洞巾；取大鼠术眼眼球颞上方角膜缘后2～2.5 mm处，以角膜缘为基底，做长2～3 mm的结膜瓣，剪开球结膜后分离Tenons囊至巩膜面，取24G胰岛素针针头于距角膜缘约0.5 mm处穿刺入前房，注入黏弹剂以维持前房，取25G长度3～4 mm微管，将穿入前房端剪成斜面，斜面向上，末端为平面，沿着巩膜隧道穿刺入前房。植管成功后，采用10-0线连续缝合球结膜及Tenons囊，术后结膜囊内涂抹红霉素眼膏(广州白云山医药集团股份有限公司，国药准字H44023089)。术后待大鼠完全清醒后，送回饲养房，注意保暖，术后3 d内双眼均滴注0.25%氯霉素滴眼液(长春迪瑞制药有限公司，国药准字H22023503)，2次/d。

三、眼压测定

诱导麻醉及表面麻醉同上，使用Tonolab眼压计(上海慕聚医疗器械有限公司)测量A-H组各时间点的SD大鼠术眼(右眼)眼压，具体方法[7]为保持测量探头水平且位于距角膜3～5 mm角膜顶点处，使得探头水平与视轴夹角≤25°，测量6次，取平均值。

四、取材及标本处理

A组大鼠于实验室饲养1周后处死；B-H组大鼠分别于各时间点测量眼压，手术完成后1、3、5、7、14、21及28 d处死，剪取滤过区结膜及结膜下组织，使用细胞裂解液提取总蛋白，行Western印迹法(具体步骤如下文)检测TGF-β[8]。

五、Western印迹法检测TGF-β

对A-H组大鼠取得的总蛋白进行凝胶电泳后将蛋白印记转移至聚偏二氟乙烯膜[9]，室温下封闭液封闭1 h，加入一抗稀释液：兔抗大鼠单克隆抗体TGF-β1(美国Abcam公司，1:400稀释)或小鼠抗大鼠单克隆抗体TGF-β2(美国Abcam公司，1:5000稀释)，室温下孵育2 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。再加入二抗稀释液：山羊抗兔抗体(中国康为世纪公司，1:5000稀释)，室温下孵育1 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。采取增强化学发光法显示迹象，在感光底片上曝光后保存结果，将显影后X线片扫描成图片后，采用凝胶图像分析系统，以测得GAPDH的灰度扫描为基线水平对蛋白条带进行灰密度值读数并记录[10]。

六、统计学分析方法

结果采用SPSS 18.0统计学软件进行处理并进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

所有SD大鼠术后一般情况好，精神、活动及饮食正常；术眼眼睑未见明显红肿，结膜囊未见感染，球结膜切口对合好，缝线在位，未见感染；滤过泡完整，未见渗漏，可见不同程度隆起；角膜透明，未见水肿及缺损；前房未见出血，可见不同程度房水闪辉及房水细胞，术后2～4 d内消失。

一、结膜滤过泡形成情况

B-H组均在术后1 d成功建立不同程度隆起的球结膜滤过泡，滤过泡生存时间7～23 d，平均(13.26±5.73)d，一般术后4～5 d滤过泡出现表面血管化。

二、SD大鼠术后眼压变化情况分析

术眼在术后眼压先下降后回升至正常，术后1～5 d术眼眼压低于正常组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 A-H组大鼠眼压变化情况(mmHg)

三、SD大鼠术后TGF-β表达分析

将B组-H组SD大鼠数据汇总，与A组相比，Western印迹法显示TGF-β1及TGF-β2均在术后1 d明显增高，TGF-β1持续至术后5 d达峰值，TGF-β2持续至术后7 d达峰值，随后均逐渐降低至术后 28 d，但表达量仍高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2，3。

表2 A-H组大鼠术后Western印迹法检测TGF-β1蛋白相对表达

表3 A-H组大鼠术后Western印迹法检测TGF-β2蛋白相对表达

讨 论

一、青光眼滤过性手术滤过泡瘢痕化形成机制

青光眼滤过性手术作为一种外科手术，对患者眼部的角膜、巩膜、结膜、虹膜及小梁网等均可能形成损伤，同时可造成微血管破损，导致红细胞、血小板及血浆蛋白的渗漏，进而刺激局部激素的释放，如组胺、5-羟色胺等[11]。随着患者体内血小板的活化，一方面参与凝血，另一方面释放各类生长因子，如血小板衍生生长因子(platecet derived growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。同时，一些细胞因子如TGF-β也被释放，患者体内中性粒细胞及单核细胞聚集，在TGF-β的诱导下单核细胞转化成巨噬细胞，促进患者体内的炎症反应。PDGF与TGF-β是重要的促纤维化细胞因子，可以有效激活成纤维细胞。在炎症反应中，巨噬细胞及血小板活化产生的PDGF可刺激成纤维细胞及炎症细胞产生TGF-β，TGF-β的增多进一步反馈刺激其他成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞，促进合成胶原蛋白[12]。在此基础上，血小板分泌的促血管生长因子(如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子) 、巨噬细胞、伤口处低氧及乳酸形成的环境均参与协同血管形成。在血管形成的过程中，会出现黏蛋白沉积，Ⅰ型胶原蛋白逐步取代Ⅲ型胶原蛋白，之后胶原蛋白发生交联及脱水，肉芽组织内的成纤维细胞逐渐凋亡，导致细胞成分减少，最后转变为瘢痕组织[13]。

二、TGF-β在大鼠术后滤过泡瘢痕化过程中的表达

本次研究采用SD大鼠制备模型，并用Western印迹法检测大鼠滤过区结膜及结膜下TGF-β1及TGF-β2的动态表达。通过不同时间点的检测发现，TGF-β1及TGF-β2均在术后均呈现升高趋势，TGF-β1持续至术后5 d达峰值，TGF-β2持续至术后7 d达峰值，随后均逐渐降低至术后28 d，但表达量仍高于正常对照组。在大鼠模型制备过程中，手术操作属于损伤性手术，会对大鼠眼部血-房水屏障造成破坏，血浆及活化的血小板分泌释放TGF-β前体，同时手术区域也会分泌TGF-β，由此可以解释术后1 d TGF-β明显升高的现象。当滤过区局部TGF-β浓度升高至一定程度后，会刺激结膜囊成纤维细胞，促进滤过区巨噬细胞及单核细胞分泌TGF-β，因此术后TGF-β1及TGF-β2与大鼠滤过泡瘢痕化进程呈现一致性[14]。

三、针对TGF-β信号通路的治疗方法

由青光眼滤过性手术滤过泡瘢痕化形成机制及动物实验可以发现，TGF-β在滤过泡瘢痕化形成中发挥重要作用，因此可以针对TGF-β信号通路采取相应的治疗方法。TGF-β生物效应复杂多样，参与调节细胞分化、促进血管生成及促进炎症反应等。TGF-β单体发挥其生物学作用一般通过信号转导通路，包括Smad通路及非Smad通路(Rho激酶信号通路、AKT信号通路及P38/MAP通路)[15]。在Smad通路中TGF-β与细胞表面跨膜受体TGF-β1受体和TGF-β2受体相结合，活化素受体激酶被活化，促使细胞内信号转导蛋白Smad 2和Smad 3磷酸化，与Smad 4形成复合物，进一步调控下游基因转录。Rho激酶信号通路在细胞的信号转导通路中可作为信号转换器或分子开关，作用于细胞骨架或其靶蛋白，进而调控基因转录及细胞周期等。因此，临床上可针对TGF-β信号通路采用相对应的抑制剂，进而抑制滤过区瘢痕化，临床上亦有相关报道。

四、结论

TGF-β1及TGF-β2参与球结膜滤过泡瘢痕化过程，两者表达量的增加与瘢痕化进程一致。