缺氧条件下‘黄富士’苹果挥发性成分变化趋势研究

李恒伟 王庆国

摘要：通过测定‘黄富士苹果在缺氧条件下挥发性产物含量的变化，分析挥发性成分变化与缺氧伤害的关系，为苹果低氧伤害的预警，保证气调贮藏品质提供基础方法。通过固相微萃取（SPME）技术萃取，采用气相色谱-质谱寐用技术，对缺氧条件下2、4、6、8、10天挥发物进行成分分析。研究发现，随着缺氧时间的延长，苹果中共有18种挥发性成分含量下降，6种挥发性成分上升。筛选出的24种挥发性成分与缺氧伤害存在相关性，可为进一步筛选缺氧预警指标、研究缺氧伤害机理提供参考。

关键词：‘黄富士苹果;缺氧伤害;挥发性物质;预警指标;气相色谱-质谱寐用

中图分类号：TS255.3文献标志码：A论文编号：cjas2021-0131

The Changing Trend of Volatile Components in ‘Yellow FujiApple Under Hypoxia Condition

LI Hengwei，WANG Qingguo

（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271000，Shandong，China）

Abstract：The purpose of this study is to determine the changes in volatile product contents of ‘Yellow Fujiapples under hypoxic condition，analyze the relationship between the changes in volatile components and hypoxia injury，and provide a basic method for early warning of hypoxic injury of apples and ensuring the quality of controlled atmosphere storage. The extraction was carried out with solid phase microextraction （SPME）technology，the analysis of volatile components in 2，4，6，8 and 10 days under hypoxic condition was conducted by using gas chromatography- mass spectrometry technology. The study found that with the prolonged period of hypoxia，the contents of a total of 18 volatile components in apple decreased，and the contents of 6 volatile components increased. 24 volatile components screened out were related to hypoxia injury. The study could provide certain references for further screening of hypoxia early warning indicators and research on the mechanism of hypoxia injury.

Keywords：‘Yellow FujiApple;Hypoxia Injury;Volatile Substances;Warning Indicators;GC-MS

0引言

苹果（Malus domestica）是国内的大宗果品之一，它营养丰富，具有很强的抗氧化性，有抗癌减脂等功效[1]。目前国内最常见的苹果贮藏方式為冷库贮藏与气调贮藏[2]，低温环境中苹果对O₂更敏感，短时条件下低浓度O₂可降低苹果生理代谢水平，减少乙烯生物合成，延长苹果采后贮藏期[3]。但长期气调贮藏中过低的氧分压易导致缺氧伤害发生，造成苹果果皮木栓化、果肉组织坏死并伴有浓烈发酵味[4-5]。因此，控制‘富士果实长期气调冷藏过程中的最适、最低O₂浓度尤为重要[6]。近年来苹果超低氧气调逐渐得到应用，但苹果在多种生理伤害与成熟衰老中乙醇释放量均会上升，造成难以判断气调贮藏氧分压是否达到苹果耐受阈值。气相色谱-质谱联用分析具有灵敏、快速、简便、精确等优点，近年来在果蔬挥发性化合物分析领域得到广泛应用。本研究分析‘黄富士苹果缺氧气调过程中挥发性化合物成分的变化，筛选与缺氧伤害存在相关性的物质，旨在为进一步研究缺氧伤害机理提供参考。

1材料与方法

1.1实验时间、地点

实验于2020年10—11月在山东省泰安市山东农业大学食品科学与工程学院进行。

1.2实验材料

‘黄富士苹果于2020年10月采收自山东省烟台市，采收后运送至山东农业大学食品科学与工程学院冷库，回温48 h后放置于0℃冷库开始实验。

1.3仪器设备

美国Mettler Toledo公司ML204电子天平，上海一恒DHG-9240A电热鼓风干燥箱，德国CNW 20 mL顶空进样瓶，康宁Exceed-Bc-08艾柯纯水仪，日本岛津GC2010气相色谱-质谱联用仪，美国Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，美国Thermo Fisher VF-Wax毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），天津森罗气调贮藏配气系统，天津森罗50 L水封气调箱，江苏赛普公司制氮机，泰安迎春气体二氧化碳气瓶。

1.4实验方法

1.4.1苹果缺氧气调处理取30个‘黄富士苹果，放置于50 L水封气调箱（于0℃冷库内放置）中。设定气调箱气体浓度为0% O₂、0% CO₂;每隔48 h对箱内挥发性成分进行取样并测定，重复3次，气调持续10天。

1.4.2苹果挥发性物质取样方法将DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入气相色谱仪进样口于250℃条件下老化2 h，老化结束后将萃取头快速放置于气调箱内对挥发性气体成分进行萃取40 min后取出，并插入气相色谱仪进样口，于250℃下解吸5 min。实验重复3次。

1.4.3GC-MS条件使用VF-WAX毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），程序升温为40℃保持3 min，先以6℃/min升至80℃保持1 min，后以6℃/min升温至110℃保持1 min，再以7℃/min升温至140℃保持1 min，最终8℃/min升温至230℃保持5 min。进样口温度为250℃，不分流，载气为氢气（纯度99.999%），柱流量为1.00 mL/min，总流量为14.0 mL/min，离子源温度210℃，接口温度230℃，检测器相对电压为0.1kV，扫描范围为33～500 m/z。萃取头在进样口脱附时间为5 min。

1.5数据分析

实验中使用Excel、SPSS等软件及岛津工作站进行数据分析。

2结果与分析

2.1不同伤害时间对苹果挥发性物质成分的分析

对缺氧伤害条件下的挥发性成分相对含量与绝对含量采用自动积分（Peak Width：4.0 s，Slpoe Sensitivity：100，Peak Size Reject：100）、面积归一法进行计算，并对各峰质谱图进行NIST谱库检索和人工分析，对不同伤害时间处理后获得的挥发性气体样品进行GC-MS分析。

不同缺氧时间处理‘黄富士挥发性成分如表1所示。实验共检测到46种挥发性成分，随着缺氧气调时间的延长，香气成分数量逐渐降低，缺氧气调10天時样品中挥发性成分减少为37种。

对表1中各挥发性物质进行分类得表2。随着缺氧时间延长，酯类、酸类与芳香烃类物质含量逐渐下降，而醇类、醚类和其他挥发性物质随缺氧伤害加重含量上升。

2.2‘黄富士苹果缺氧伤害挥发性物质主成分分析

主成分分析是将多个指标化为少数几个不相关的综合指标，并对综合指标按照一定的规则进行分类的一种多元统计分析方法[7]。这种分析方法能够降低指标维数，浓缩指标信息，将复杂的问题简化，从而使问题分析更加直观有效[8]。它也适用于不同气调时期挥发性物质间的相关依赖性。将‘黄富士苹果5个不同气调时期的所有定性大于85%的挥发性化合物进行PCA分析。如图1所示，第一主成分（PC1）的贡献率为72.72%，第二主成分（PC2）贡献率为16.57%，累计贡献率为89.29%。

由图1可以发现，在‘黄富士苹果缺氧伤害中，各挥发性物质在PCA分析中主要聚集为2类。PCA分析中各因子距离越近，表明其相关性越高。1，2，4-三甲基苯、异戊酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、乙酸异丁酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丙二醇甲醚、戊酸丁酯、间二甲苯、对二甲苯、丁酸丁酯、丙酸正戊酯、苯甲醛、正己醛、甲苯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、己酸异戊酯等18种物质随缺氧伤害发生存在相关性;丁基呋喃、二丁醚、丁酸丙酯、丙酸正丙酯、丙酮酸乙酯、乙醇等6种物质在缺氧伤害中存在相关性。

2.3相关性物质分析

对主成分分析中筛选出的2类相关性物质进行分析，可以发现2类物质含量分别随缺氧气调时间延长而呈现上升和下降趋势，对各物质分别进行分析并作图。其中含量随时间发生突然性上升/下降的物质，其含量剧烈变化可能与缺氧伤害发生相关，并可能作为缺氧伤害预警指标。由图2可以发现，2-甲基丁酸-2- 甲基丁酯与乙酸异丁酯含量变化相似，均随缺氧伤害的加重含量下降，其对缺氧伤害存在持续响应且受到伤害抑制，与缺氧伤害存在相关性。

由图3可知，戊酸丁酯、对二甲苯、间二甲苯、丙二醇甲醚4种物质含量均在缺氧2～4天时下降，6天后物质消失。其成分显著受缺氧抑制，且随着缺氧伤害的加重含量迅速降低。

如图4所示，苯甲醛与甲苯在‘黄富士苹果香气中的含量随缺氧时间的延长而降低。缺氧前6天，其含量逐步下降，随着缺氧伤害的加重，6天后苯甲醛和甲苯消失。缺氧伤害对苯甲醛和甲苯的产生有明显抑制作用。

如图5所示，2-甲基丁酸乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、丙酸正戊酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸丁酯、异戊酸己酯、己酸异戊酯8种酯类在缺氧过程中前6天含量随时间下降，缺氧6天后含量保持稳定无显著差异（P<0.05）。8种酯类均在缺氧6天时存在含量变化拐点，与前人研究发现低氧处理抑制脂氧合酶（LOX）活性相互印证[9-12]，说明其受缺氧伤害抑制并与缺氧伤害存在相关性。

如图6所示，1，2，4-三甲基苯、正己醛在缺氧过程中前6天含量随时间下降，缺氧6天后含量保持稳定无显著差异（P<0.05），均在6天时存在含量变化拐点，与缺氧伤害存在相关性。

如图7所示，丙酸正丙酯、丁酸丙酯、丙酮酸乙酯和二丁醚含量随着缺氧伤害的加重逐渐上升，其变化趋势显然与缺氧伤害存在相关性，可作为缺氧伤害预警指标。

如图8所示，丁基呋喃在缺氧2天时含量极低，缺氧4天后随缺氧伤害加重含量快速上升;乙醇含量在缺氧前4天保持不变（P>0.05），4天后含量随缺氧伤害加重而增加。丁基呋喃和乙醇含量变化与缺氧伤害存在显著相关性，可作为预警缺氧伤害发生的指标。

3结论

苹果的香气是一个较复杂的混合物，由许多具有特征香气的挥发性物质组成[13-15]。本研究通过GC-MS与固相微萃取技术，对‘黄富士苹果缺氧气调过程中挥发性物质进行了鉴定。研究发现，随着缺氧伤害的加重，酯类、酸类与芳香烃类物质含量逐渐下降，而醇类、醚类和其他挥发性物质含量上升。通过主成分分析与含量变化趋势分析，筛选出1，2，4-三甲基苯、异戊酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、乙酸异丁酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丙二醇甲醚、戊酸丁酯、间二甲苯、对二甲苯、丁酸丁酯、丙酸正戊酯、苯甲醛、正己醛、甲苯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、己酸异戊酯、丁基呋喃、二丁醚、丁酸丙酯、丙酸正丙酯、丙酮酸乙酯、乙醇等24种物质与缺氧伤害存在显著相关性。且相较于乙醇、丙酸正丙酯、丁酸丙酯、丙酮酸乙酯、二丁醚和丁基呋喃对缺氧伤害反应更灵敏，这些物质是进一步分析筛选缺氧伤害发生的预警指标。

4讨论

通过GC-MS分析，可有效进行果蔬品种鉴别、生理病害检测、原产地溯源、风味品质[16]判断等。在国内，孟志鹏等[17]通过检测不同品种苹果挥发性成分差别，找出了‘瑞雪、‘瑞香红苹果特征性香气物质;张虎平等[18]利用代谢组学方法成功建立库尔勒香梨套袋与非套袋代谢指纹图谱;邱爽等[19]利用GC-MS与Pearson相关性分析结合产地生态因子，发现了环境因素与樱桃香气成分的关系。以上研究均是有效结合气相色谱-质谱与主成分分析技术，确定挥发性成分与外部因素的相关性。

目前，缺氧胁迫下果实可溶性固形物、有机酸以及酶类活性的变化已有大量研究[20-22]，对缺氧伤害中挥发性物质变化的研究，既有助于改进现代气调保鲜技术，实现气调贮藏中氧气浓度的低限精准控制，提高果蔬气调效果，分析挥发性化合物的合成代谢通路，也有助于分析和筛选与胁迫有关的候选基因和候选蛋白[23-25]，从分子生物学层面揭示果实应对缺氧胁迫的反应机制。

本研究通过对果实挥发性成分变化与缺氧胁迫间关系分析发现，部分挥发性成分与缺氧伤害存在关系，且找出了可作为缺氧伤害发生预警性指标的挥发性成分。但尚不明确缺氧胁迫对果实挥发性物质合成的分子调控与基因调控机理，对调控机理需做更进一步研究。

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