维生素C和多西环素联用对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用*

赵 岩 赵斐然 满永宏 杨 乐 张 驰

(南阳医学高等专科学校 河南南阳 473000)

肝癌是全球第六大常见癌症[1]，严重威胁人民健康[2]。手术切除仍是治疗肝癌的首选方法，但大多数肝癌在发现时已处于晚期。手术治疗机会丧失，术后复发率高，远期疗效不理想[3]，非手术治疗在肝癌治疗中占有重要地位。对于不能手术治疗的肝癌患者，临床上常用的治疗方法是化疗，但肝癌对常用化疗药物不敏感，总体疗效不理想。因此，寻找一种新型的肝癌化疗敏感药物已成为学者们的研究热点。

传统化疗药物由于缺乏对肿瘤细胞的选择性杀伤，在杀死癌细胞的同时，也出现了造血系统和胃肠系统等副作用，部分患者甚至因为严重的毒副作用而危及生命。再加上有一部分化疗药物价格昂贵，也加重了肿瘤病人的经济负担。维生素C和Doxycycline都是临床上常用且无明显副作用的的药品，价格低廉，如果能有效控制肝癌的生长，完全可以利用维生素C和Doxycycline作为化疗药物应用于肝癌的治疗，这也是该课题研究的重要目的。

1材料与方法

1.1 实验试剂

HepG2：人肝癌细胞株从中国医学科学院基础医学研究所购买；双抗(青霉素和链霉素)RPMI-1640细胞培养液(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco) ；vitamin C 和doxycycline(Sigma)；MTT试剂盒(上海生工科技有限公司)；甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒(原子高科科技公司)；γ-GT酶检测试剂盒(南京建成生物有限公司)；Fas、Bcl-2、Bax免疫组织化学检测试剂盒(南京建成生物有限公司)。

1.2实验仪器

CO2培养箱(Thermo公司)；倒置荧光显微镜(Nicon公司)；酶标仪(Bio-Tek公司)；高速冷冻离心机(Thermo公司)；紫外—可见光双光束扫描分光光度计(Thermo公司)；DG5033A型酶联免疫检测仪(南京华东科技有限公司)；KHA-420型生化检测仪(济南金浩峰有限公司)；SN-697型γ放射免疫计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)。

2实验方法

2.1细胞体外培养及分组

RPMI-1640培养基加入10%热灭活胎牛血清和双抗(100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，37°C的温度下在5% CO2培养箱中体外培养人肝癌HepG2细胞，处于对数生长期的肝癌细胞用于实验。实验分为四组：对照组不用药，另设空白对照孔(只加培养基，无细胞)，每组设3个重复孔。治疗组分为低浓度组(维生素C2.0mM和Doxycycline10mg/L联合)和高浓度组(维生素C10.0mM和Doxycycline40mg/L联合)，体外干预培养人肝癌细胞系HcpG2细胞72h。

2.2 MTT比色法

对数生长期细胞接种于96孔培养板中，每孔接种密度为1×104个细胞/100μL。细胞生长12h后，干预组分别加入高低两种浓度维生素C和Doxycycline联合药物进行干预，每组设立3个重复孔。联合药物干预72h后，每孔加入10μL浓度为5g/L的MTT溶液，再培养4h后用490nm的波长测定吸光度值。细胞增殖抑制率=(对照组A平均值-实验组A平均值)/对照组A平均值×100%。上述实验重复3次。

2.3样品制备及指标的检测

将对数生长期的HepG2细胞消化制备细胞悬液，按1×106/ml密度接种在有盖破片的六孔细胞培养板中，每组设立3个样品。等细胞贴壁后在培养箱中常规培养12h后进行干预实验，治疗组分别用高低两种浓度维生素C和Doxycycline联合使用进行干预72h，实验结束后用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况变化，收集细胞培养液，用放射免疫法测定细胞培养液中AFP和分光光度法测定γ-GT的活性，免疫组化法测定凋亡蛋白Fas、Bcl-2、Bax的表达并同时测定其灰度值。上述实验重复3次。

2.4 统计方法

3结果

3.1用Vitmin C和Doxycycline联合干预后的细胞生长情况观察

用Vitmin C和Doxycycline联合干预3d后，在倒置显微镜下观察肿瘤细胞的生长情况，结果显示：对照组肿瘤细胞在培养板中贴壁密集分布，细胞核大，细胞饱满，呈现生长旺盛的表现。干预组的细胞呈现稀疏分布，时有细胞脱落，细胞核仁缩小，胞浆减少，胞浆内可有空泡，细胞形状为三角形或不规则形，总体呈现生长弱势的表现，详见图1。

对照组

干预组

3.2 MTT 法检测Vitmin C和Doxycycline联合对HepG2细胞增殖活性的影响

由表1可知，用Vitmin C和Doxycycline联合干预后，与对照组相比能显著降低HepG2 细胞的增殖活性，选定的两个浓度的对HepG2细胞增殖活性的影响差别无统计学意义。

表1 Vitmin C和Doxycycline联合对HepG2细胞增殖活性的影响

3.3 Vitmin C和Doxycycline联合对HepG2人肝癌细胞肿瘤标志物(AFP、γ-GT)和凋亡蛋白(Fas、Bcl-2、Bax)的影响

干预组与对照组相比AFP的分泌量和γ-GT活性有明显下降(p<0.05)，说明Vitmin C和Doxycycline联合能够抑制肿瘤细胞生长的活性。凋亡蛋白(Fas、Bcl-2、Bax)干预组与对照组相比显著增加(p<0.05)，提示Vitmin C和Doxycycline可能通过增加肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的生长，详见表2。

表2 Vitmin C和Doxycycline联合对HepG2人肝癌细胞肿瘤标志物(AFP、γ-GT)和凋亡蛋白(Fas、Bcl-2、Bax)的影响

4讨论

Doxycycline是1953年发现的一种长效四环素类抗生素。其抗菌谱和四环素大致相同。它具有良好的水溶性和脂溶性，能抑制多种病原微生物的蛋白质合成，广泛用于莱姆病、军团病、疟疾等多种病原体引起的感染。除抗菌作用外，Doxycycline对类风湿性关节炎、腹主动脉瘤和肠系膜缺血也有良好的治疗作用。此外，研究发现Doxycycline对如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤也有显著的生长抑制作用，其作用机制是通过作为非特异性的基质金属蛋白酶抑制剂和血管生成抑制剂等作用有关[4-5]。维生素C(VitC)作为临床常用药物，广泛应用于各种临床疾病(如坏血病、肝硬化等)的治疗。近年来研究发现,VitC在肿瘤的治疗和预防中也有一定作用，其抗肿瘤作用机制包括诱导细胞凋亡、 防止细胞DNA损伤、细胞周期阻滞及促进肿瘤细胞自裂和自噬[6-7]。

肿瘤细胞凋亡与恶性肿瘤的发生发展密切相关，一部分的肿瘤的发生是因为细胞凋亡的正常过程受到抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡，因此肿瘤细胞因分化或凋亡受阻而生长失控[8]。细胞凋亡指的是细胞在自身生理或病理性因素的诱导，而发生一种自发的、程序性的死亡，细胞凋亡的机制比较复杂，它与多种癌基因有关，其中Fas/FasL、Bcl-2、Bax等被认为与肿瘤细胞凋亡关系最密切[9-10]。Fas和Fas-L分别为死亡受体和配体，二者相遇就会启动死亡程序发生凋亡，Bax和Bcl-2 是功能相反的凋亡蛋白，Bax促进凋亡的发生，而Bcl-2抑制凋亡的发生[11-12]。 某些药物可能具有诱导细胞凋亡的作用，诱导肝癌细胞凋亡的策略成为近年来肝癌治疗的热点。AFP和γ-GT是临床中诊断肝癌的重要肿瘤标志物，正常的成熟肝脏细胞中AFP和γ-GT的表达量极底，当正常的肝脏发生癌变时AFP和γ-GT的含量就会升高，所以通过体外测定肝癌标记物的变化就能间接的反映肝癌细胞的生长情况[13-14]。

该实验在前人研究的基础上，有了Doxycycline联合VitC使用来干预人肝癌HepG2细胞的设想，通过细胞生长状况观察、MTT 法检测和肝癌肿瘤标志物的测定发现联合药物能够抑制肿瘤细胞的生长，通过对其抑制肿瘤生长的机制的探索结果表明，与对照组相比凋亡蛋白(Fas、Bax)含量的增高而凋亡抑制蛋白Bcl-2含量下降，说明其抑制肿瘤的作用与提高肿瘤细胞的凋亡有关。虽然样本数量有限，但为原发性肝癌的化疗治疗提供了一定的理论依据。