携带ermB耐药基因肺炎链球菌血清学分型及ST序列分析*

宋相泉 赖剑秀 徐菊芳 段达荣

(1杭州市西湖区中西医结合医院检验科 浙江杭州 310000；2台州市第一人民医院检验科 浙江台州 318020)

肺炎链球菌是儿童社区获得性感染的重要病原菌，可导致肺炎、气管炎、鼻窦炎和中耳炎等非侵袭性感染，以及脑膜炎、败血症和脓毒症等侵袭性肺炎链球菌疾病(invasivepenemococcal diseases，IPD)，是导致全球儿童感染和死亡居高不下的主要原因之一，IPD每年可导致全球100万人死亡[1]。据报道，中国 5 岁以下儿童肺炎病例中肺炎链球菌检出率为5.2～11.0%[2]，为保障儿童健康，世界卫生组织(WHO)将肺炎链球菌疾病列为需“极高度优先”使用疫苗预防的疾病[3-4]。携带ermB基因S.pn不断增加的耐药趋势和播散形势引起广大临床工作者的关注，已成为全球性公共卫生问题。在对耐药机制研究的同时，研究人员正在采用MLST方法对菌株的播散特征进行分子流行病学研究，追踪菌株间的遗传特性和宏观进化过程。该研究将临床分离的携带ermB基因肺炎链球菌进行血清学型鉴定及多位点序列分型(MLST)，为疫苗免疫预防的可行性及菌株的流行病学提供参考依据。

1材料与方法

1.1研究对象

选取2018年1月至2019年6月杭州市西湖区中西医结合医院保存的下呼吸道感染患者分离的肺炎链球菌，符合条件的菌株59例。其中男36例，平均年龄33.64±16.82月;女23例，平均年龄24.83±16.97月。

纳入标准：①患者年龄≤5岁，剔除重复菌株；②ermB耐药基因检测阳性；③病人信息记录完善者。

1.2 仪器与试剂

台式高速离心机(PICO 17)，超微量分光光度计(NANO-DROP)，核酸电泳仪(PAC 3000)，凝胶成像系统(GIS-1600)， 扩增仪(ABI 7500PCR)，二氧化碳培养箱(MCO-15CA)。青霉素、头孢曲松及头孢噻肟E-test 试条均购自温州康泰生物科技有限公司，引物由合肥麟美生物科技有限公司代为合成。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 肺炎链球菌在哥伦比亚血琼脂平板上培养24 h，传代后收集整个血平板上菌落，用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA。

1.3.2 PCR引物 ①aroE(405bp) Forward： 5′-GCC TTT GAG GCG ACA GC；②gdh(460bp) Forward： 5′-ATG GAC AAA CCA GC(G/A/T/C) AG(C/I) TT；③gki(483bp) Forward： 5′-GGC ATT GGA ATG GGA TCA CC；④recp(450bp) Forward： 5′-GCC AAC TCA GGT CAT CCA GG；⑤spi(474bp) Forward： 5′-TTA TTC CTC CTG ATT CTG TC；⑥xpt(486bp) Forward： 5′-TTA TTA GAA GAG CGC ATC CT；⑦ddl(441bp) Forward： 5′-TGC (C/T)CA AGT TCC TTA TGT GG。

1.3.3多价疫苗分类 多价疫苗PCV7是指：(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)；PCV13是指在PCV7基础上增加血清型(1、3、5、6A、7F、19A)。

1.3.4 肺炎链球菌血清学分型及耐药基因检测 采用PCR方法检测大环内酯类耐药基因ermB和mefA/E；多种PCR反应体系来鉴定常见的19种S.Pn血清型，体系1可鉴定6A/B、9V、15B/C、18C及19F血清型；体系2可鉴定3、14、19A及23F；体系3可鉴定1、4、5、23A；体系4可鉴定15A、7F及22F；体系5可鉴定20、34及33F。

1.3.5多位点序列分型MLST 将肺炎链球菌7个管家基因：aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt、ddl的PCR产物分别测序后，运用DNAssist Version 2.2软件进行数据分析。与肺炎链球菌MLST数据库(http：//spneumoniae.mlst.net/)中的标准序列进行比对后，在Locus Query中输入裁剪后的序列，得到allele number。将每个标本的7个allele numbers输入Profile OuerV(a11elic)，查出相应的ST。

1.4统计学分析

应用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用百分率(%)表示，组间差异用χ2检验和Fisher确切概率法，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同年龄组与不同性别血清型及疫苗覆盖率比较

血清分型主要以3(37.29%)、19A(16.95%)及6A/B(15.25%)为主；不同性别比较，血清型与疫苗覆盖率均无统计学意义(p>0.05)；不同年龄组比较，血清型3在0～12月、13～36月和37～60月三组之间有统计学意义(p=0.032)，其余血清型不同年龄组比较均无统计学意义(p>0.05)，见表1。

表1 血清型与疫苗覆盖率在不同年龄组及不同性别患儿比对[菌株数(%)]

2.2血清型与ST序列及多重耐药率构成比关系

S.Pn菌株主要ST分型为ST271(15.25%)、ST505(15.25%)、ST902(6.78%)、ST6989(5.08%)；ST11972、ST3173、ST458各检出2株，占比均为3.39%；新型ST序列共为2株，占比为3.39%；ST序列各为1株，共有25株，占比合计为42.37%。ST271主要血清型为19A，多重耐药菌株百分比为44.44%：复方新诺明+四环素+红霉素；ST505与ST6989均为血清型3，多重耐药菌株百分比分别为88.88%与66.67%，ST505主要耐药模式为：复方新诺明+四环素+红霉素+美洛培南；ST902与ST3173血清型均以6A/B为主；多重耐药菌株百分比均为50.00%；新型ST序列均为6A/B；其它ST序列共有25株，占比42.37%，多重耐药菌株百分比均为64.00%，详见表2。S.Pn7个管家基因电泳图见图1。

图1 S.Pn 管家基因 PCR产物电泳图

3讨论

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae) 是革兰阳性菌，目前已鉴定出97 种荚膜血清型[5]。该研究结果显示：血清型主要为3(37.29%)，与江艳霞[5]等报道的血清型3构成比为3.8%和刘莹[6]报道的构成比仅为0.8%以及雷磊[7]等报道的血清型主要为19A(70.1%)，在血清型排序和所占比例存在很大的差异，该研究血清型3占比极高，可能原因为：①流动人口的传播：杭州地区为省会城市，且经济发达，国际交流广泛，人口流动频繁，这些均促使了血清型3菌株在该地区的传播；②另外可能是抗生素选择压力，在压力下菌株可发生变异，导致荚膜转换；③也可能与国家或地区引入的疫苗种类不同有关。不同年龄组血清型3在三组之间比较差异有统计学意义，其中以13～36月构成比最高，37～60月构成比最低，由于血清3在PCV13范畴内，因此13～36月儿童更应加强PCV13疫苗接种。另外，该研究发现：血清型在不同性别间差异无统计学意义，因此当地学龄前儿童S.Pn疫苗的接种，可以不用考虑性别的差异。

该研究的PCV13疫苗覆盖率远高于PCV7疫苗覆盖率，主要原因为该实验中血清型3和19A占比很高，且都属于PCV13疫苗范畴。另外，研究发现：PCV13覆盖率均高于Zhou HJ[8]等报道的89.3%和Lyu S[9]等报道的87.8%，PCV7均低于刘勇[10]等报道的57.4%及李静[11]等报道的76.1%；对于PCV覆盖率的差异，Kim[12]等报道指出可能与地区差异有关。鉴于该研究中的PCV13的覆盖率高，且未在PCV13范畴的22F，占比仅为1.69%，提示当地儿童推广接种PCV13疫苗能有效预防肺炎链球菌感染，对控制该菌耐药性的播散也有重要的意义。

多位点序列分型(MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，操作简单，结果快速，并且便于不同实验室的比较。目前已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究，随着分析软件的发展，测序速度加快和成本降低，MLST逐渐成为细菌的常规分型方法。该次MLST分型共检出35种ST，以ST505与ST271菌株数量最高，构成比均为15.25%，随后依次为ST902(6.78%)，ST6989(5.08%)与ST11972(3.39%，与张敏[13]等及王乐雨[14]等报道的S271均为优势群，占比最高一致，但ST505无论在排序还是构成比方面与两者的报道都存在着很大的差异。另外，研究还发现，此次分离的ST505血清型均为3型，推测ST505与血清型3存在着高度相关性，相关性程度和机制有待于进一步研究，ST271菌株血清分型中，以19A为主(44.44%)；ST320、ST236与ST81各检出一株，对应的血清型分别为3、19A和19A，与Zhou H[15]等报道的ST271、ST3173、ST320、ST236、ST81分别与血清型19F、19A、6A、19F、1高度关联性，存在着一定的差异。S.pn分子流行病学网(http：//www.sph.emo ry.edu/pmen)目前已确认43个S.pn克隆株[16]。此次检测的ST菌株中有19株归属于流行克隆菌株，其中ST505(9株)为CC505群，ST271(9株)和ST320(1株)为CC271群，其他ST序列分布比较散开，说明该地区S.pn 在基因水平上有着不同程度的多样性与复杂性。本实验中ST271、ST505与ST320均为国际流行克隆菌株，ST320仅分离到1株，其余均为ST271与ST505，ST505菌株多重耐药百分比明显高于ST271，可能与该次ST505菌株血清型均为3有关，张艳琳[17]等指出：3 型肺炎链球菌在增殖的过程中会产生更多的荚膜多糖，进而形成更强的抗吞噬功能。此外，3型肺炎链球菌更容易进入脑脊液进而引发炎症，导致毒性基因的转录水平升高。鉴于ST505作为该地区较为流行的耐药克隆群，给本地区S.Pn的感染治疗带来极大的困难，临床应给予更多的关注。

不足之处：研究的59株S.pn当中，有2株未能血清定型，可能原因为荚膜之间发生转换，导致该研究采用的PCR血清分型方法未能覆盖其血清型；另有1株因ddl位点基因未测出，而未能ST序列分型。

总之，该研究中分离的肺炎链球菌株主要的流行血清型为3、19A和6A/B。PCV13 疫苗的覆盖率达到94.92%，提示引入PCV13疫苗对于当地儿童预防和控制肺炎链球菌性疾病有重要意义；另外，不同的ST序列菌株产生的多重耐药性也存在一定的差异，临床也应引起足够的重视。