噬菌体在仔猪饲粮中的应用研究进展

■游金明 彭昕彤 谌 俊 邹田德 王自蕊

（江西农业大学，江西省动物营养重点实验室，江西省优质安全畜禽生产产教融合重点创新中心，江西南昌 330045）

近年来，随着饲用抗生素使用剂量和时间的增加，抗生素残留、耐药性细菌甚至超级细菌的出现，严重威胁着人类健康和生态环境。继欧盟之后，我国在2020年正式实施促生长类饲料抗生素（中药类除外）全面禁止使用。随着抗生素禁令的颁布，寻找并研究合适的抗生素替代品逐渐被世界所关注[1]。1915年，噬菌体首次在伦敦被发现，其可在细菌中繁殖并杀死细菌。近20年研究发现，噬菌体具有特异性强、不易产生抗性和繁殖速度快等特点。早期断奶仔猪肠道发育不全、肠道菌群定植不完善，面临着环境、营养和饲粮改变、大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的挑战，上述因素均会严重威胁断奶仔猪生长发育和肠道健康，甚至导致仔猪死亡[2]。研究发现，噬菌体可作为替代抗生素使用的一类潜在的“武器”，提高仔猪生长性能，改善仔猪肠道结构，靶向杀灭肠道致病菌，维持肠道微生物区系平衡。本文从噬菌体对仔猪生长性能、养分消化率、肠道形态、肠道菌群的影响及噬菌体控制病原菌的可能作用机制进行了综述，旨在为噬菌体在仔猪饲粮中的研究与应用提供理论基础和实践参考。

1 噬菌体简介

噬菌体是一种依赖于细菌的病毒，其可侵袭细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物[3]。噬菌体由蛋白质外壳和壳内遗传物质组成，其遗传物质为DNA或RNA，呈线状或环状，为单链或为双链[4]。噬菌体是生态系统中分布最为广泛的生物，其总数可达1030～1032个[5]。噬菌体是微生物系统中重要组成部分，平均每个细菌细胞中就含有10个噬菌体[6]。噬菌体主要分为烈性噬菌体和温和型噬菌体两类[7]。烈性噬菌体外壳上特异性蛋白识别宿主细胞后，迅速将自身核酸注入细菌体内，利用细菌体内营养快速进行自我复制和增殖，最终裂解并杀死细菌[4]。而温和型噬菌体入侵细菌细胞后，并不裂解细菌，而是将自身遗传物质与细菌遗传物质整合到一起，并随宿主菌的复制而复制[5]。温和型噬菌体通常不用作抗生素替代品，用于疾病防控与治疗。

噬菌体感染细菌的过程分为五步：①吸附：噬菌体吸附一般分为三个过程，即初步接触、可逆结合和不可逆结合[8]，初步接触是指噬菌体与宿主间的流动并引起二者之间的碰撞；第二个过程是噬菌体与宿主菌之间可逆结合，宿主菌表面受体和噬菌体结合域间的特异性连接有时是通过酶切介导[8]；第三个过程是噬菌体构象发生变化，从而有利于其将遗传物质注入宿主菌。②穿入：其可能作用机制如图1所示[9]，革兰氏阳性菌最外层是肽聚糖，内溶素作为一种重要的酶，是噬菌体在生命周期循环即将结束时所释放的，可消化宿主菌细胞壁中的肽聚糖，裂解酶也可降解肽聚糖，使噬菌体能到达细菌细胞质膜，从而有助于遗传物质注入宿主细胞；革兰氏阴性菌有一层结构复杂且高度不透水的外膜，解聚酶是噬菌体编码的蛋白质，具有类聚糖酶活性，可消化细菌细胞壁多糖（即脂多糖和荚膜多糖）需要依靠噬菌体在裂解后期编码的蛋白质——穿孔素，参与膜的通透性，内溶素穿过周质并降解肽聚糖[10]，使噬菌体遗传物质进入宿主菌。③增殖：进入宿主菌内的遗传物质利用细菌核苷酸、氨基酸等营养物质进行生物合成[11]。对于遗传物质是DNA的噬菌体来说，DNA可直接转录成mRNA，从而诱导宿主菌核糖体合成蛋白质[12]；对于遗传物质为RNA的噬菌体，RNA需逆转录为DNA，再进行与DNA噬菌体相似的过程。④装配：新合成的蛋白质通过头部的装配、尾部的装配、头与尾部结合三个过程进行组合，最后核酸与蛋白质外壳组合为子代噬菌体。⑤释放：在特殊噬菌体裂解酶的作用下，将细菌细胞进行裂解，子代噬菌体从宿主菌中释放出来并开始新的感染循环。噬菌体还可作为疫苗治疗疾病。如图1所示[9]，噬菌体疫苗分为噬菌体展示疫苗和噬菌体DNA疫苗[13]。噬菌体展示疫苗中，所需抗原的特定蛋白质或肽被设计成在噬菌体表面表达，导致免疫原性反应[14]；在噬菌体DNA疫苗中，噬菌体被用作载体，在强大的真核启动子的控制下，将外源抗原DNA导入噬菌体基因组，抗原基因将在免疫系统的靶细胞中表达[14]，从而产生免疫反应。

图1 噬菌体和噬菌体蛋白间的相互作用及其在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁上靶向结构示意图[9]

2 噬菌体对猪生长性能的影响

近年来，噬菌体在仔猪饲粮中的应用研究成为热点。Lee等[15]在教槽料中添加1 g/kg噬菌体提高仔猪断奶头数、断奶重和日增重（ADG）。Lee等[16]研究发现，与对照组相比，3.0×1010CFU产毒素大肠杆菌K88（ETEC K88）攻毒仔猪ADG显著降低（361 vs.98 g/d），而给攻毒组仔猪连续饲喂1.0×107PFU/kg噬菌体饲粮（L86噬菌体，从商业猪场猪排泄物中分离）14 d可显著提高仔猪ADG（186 vs.98 g/d）。Hosseindoust等[17]通过2×2因子设计研究了饲粮中添加噬菌体对污染猪舍或非污染猪舍中饲养仔猪生长性能的影响，研究者在试验开始前10 d将腹泻的非试验猪引入猪舍建立污染猪舍试验条件（不清理猪舍排泄物，且试验开始前不进行消毒），研究发现，污染猪舍仔猪日采食量（ADFI）和ADG均显著降低，饲喂含1 g/kg噬菌体35 d可提高仔猪ADG和饲料转化率（FCR），且仔猪FCR受噬菌体×猪舍环境交互作用影响，具体表现为：在非污染猪舍条件下，添加噬菌体对仔猪FCR无影响（0.71 vs.0.70），而在污染猪舍条件下，添加噬菌体提高仔猪FCR（0.71 vs.0.67）。江西农业大学游金明教授课题组近期研究发现，与抗生素对照组相比，200 mg/kg噬菌体组仔猪生长性能无显著差异，但400 mg/kg噬菌体组仔猪ADG、ADFI和FCR均显著提高。而与400 mg/kg噬菌体组相比，600 mg/kg噬菌体组仔猪生长性能并没有进一步提高[18-19]。这表明，噬菌体具有替代仔猪饲粮中抗生素的巨大潜力。Hosse⁃indoust等[20]分别给断奶仔猪饲喂含0.34%氧化锌、0.20%有机酸和0.1%噬菌体，试验期35 d，结果发现，尽管各组间断奶仔猪ADFI无显著差异，但相比对照组，饲粮中添加0.1%噬菌体显著提高断奶仔猪试验第0～21 d ADG和FCR，且噬菌体组仔猪生长性能与氧化锌组、有机酸组无显著差异。这表明，在促生长方面，噬菌体可作为仔猪饲粮中氧化锌和有机酸替代产品。Kim等[21]进行了两项有关噬菌体在仔猪饲粮中的试验研究，试验一发现，饲粮中添加1 g/kg或1.5 g/kg噬菌体均可显著提高断奶仔猪ADG（424或421 vs.404 g/d），而对仔猪ADFI和FCR均无显著影响；试验二进一步采用2×2因子设计研究了噬菌体与益生菌的组合效应（因子2为噬菌体水平：0 g/kg和1 g/kg；因子1为益生菌水平：0 g/kg和3 g/kg），但其结果发现噬菌体与益生菌对断奶仔猪生长性能并没有互作效应。Lee等[15]也采用2×2因子设计探讨了饲粮中添加噬菌体和氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响，因子1为氧化锌水平（0和0.34%），因子2为噬菌体水平（0和0.1%），试验期为35 d，主效应分析发现，尽管噬菌体和氧化锌对断奶仔猪ADFI无显著影响，噬菌体或氧化锌均显著提高仔猪ADG和FCR，但并没有发现仔猪生长性能受噬菌体×氧化锌互作效应的影响。总的来说，噬菌体在改善仔猪生长性能方面表现出众，尤其是在饲养环境较差的条件下，其可作为饲用抗生素、氧化锌、有机酸的有效替代品，但噬菌体与益生菌和氧化锌等并没有表现出组合效应。

3 噬菌体对仔猪养分消化率的影响

诸多研究发现，饲粮中添加噬菌体可提高仔猪养分消化率。Kim等[21]研究发现，饲粮中添加1.5 g/kg噬菌体显著提高断奶仔猪[初始体重（7.77±0.25）kg，初始日龄(24±3)d]试验第21 d粗蛋白质全肠道表观消化率和试验第35 d干物质全肠道表观消化率。Lee等[22]报道，饲粮中添加0.1%噬菌体显著提高断奶仔猪[初始体重（7.34±0.27）kg]试验第7、21 d和35 d干物质全肠道表观消化率，且提高试验第7 d和第21 d粗蛋白质全肠道表观消化率。Hosseindoust等[17]研究发现，饲粮中添加1 g/kg噬菌体提高断奶仔猪[初始体重（8.08±0.36）kg]试验第21 d粗蛋白质全肠道表观消化率。Hosseindoust等[20]研究也发现，相比对照组，饲粮中添加0.1%噬菌体显著提高断奶仔猪[初始体重（7.27±0.26）kg]试验第21 d粗蛋白质全肠道表观消化率和试验第35 d干物质全肠道表观消化率，且试验第35 d干物质全肠道表观消化率显著高于0.34%氧化锌组和0.20%有机酸组。总的来说，饲粮中添加噬菌体可提高仔猪干物质和粗蛋白质全肠道表观消化率，且其添加效果可等同于（甚至高于）氧化锌和有机酸的添加效果。

4 噬菌体对仔猪肠道形态的影响

噬菌体提高仔猪肠道养分消化率的重要原因是其可改善仔猪肠道形态。Zeng等[18]报道，与抗生素组相比，饲粮中添加400 mg/kg噬菌体显著提高断奶仔猪回肠和空肠绒毛高度、十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比值，而显著降低空肠和回肠隐窝深度。Hosse⁃indoust等[20]研究也发现，相比对照组，饲粮中添加0.1%噬菌体显著提高断奶仔猪十二指肠和空肠绒毛高度，而其与0.34%氧化锌和0.20%有机酸组仔猪肠道形态指标无显著差异。在Hosseindoust等[17]另一项研究也发现，饲粮中添加1 g/kg噬菌体显著提高断奶仔猪空肠绒毛高度。Kim等[21]研究表明，与对照组相比，饲粮中添加1 g/kg或1.5 g/kg噬菌体均可显著提高断奶仔猪十二指肠和空肠绒毛高度，但1.5 g/kg噬菌体组仔猪肠道形态与1.0 g/kg噬菌体组间并无显著差异。Lee等[22]通过2×2因子设计试验，研究发现饲粮中添加噬菌体或氧化锌均可显著提高断奶仔猪十二指肠和空肠绒毛高度，但二者之间并无交互作用。Lee等[16]研究发现，给ETEC K88攻毒仔猪饲喂1×107PFU/kg噬菌体显著提高回肠绒毛和隐窝中杯状细胞密度，并提高回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值，且降低回肠隐窝深度。总的来说，饲粮中添加噬菌体可改善仔猪小肠绒毛形态。

5 噬菌体对仔猪肠道微生物的调节作用

在实验室特定病原菌攻毒条件下，曾永娣等[19]研究发现，产毒素大肠杆菌攻毒导致断奶仔猪空肠、回肠、盲肠和结肠黏膜上大肠杆菌数及粪便中大肠杆菌数均显著增加，但给仔猪饲喂含1.0×107PFU/kg噬菌体饲粮显著降低攻毒仔猪肠道和粪便中大肠杆菌数。Cha等[23]研究发现，1×106PFU/g特异性裂解噬菌体CJ12组可显著降低产毒素大肠杆菌ETEC攻毒仔猪粪便中ETEC数。Saez等[24]报道，连续5 d给仔猪（15 kg左右）饲喂微囊化噬菌体（5×1011PFU/d）可降低鼠伤寒沙门氏菌c4232攻毒仔猪肠道鼠伤寒沙门氏菌的定植。Byoung-Joo等[25]研究也发现，噬菌体可作为抗生素替代品来控制仔猪生产中沙门氏菌的感染。在仔猪生产试验上，Lee等[22]研究发现，饲粮中添加0.1%噬菌体或0.34%氧化锌均可显著提高断奶仔猪试验第7、21 d和35 d粪便中总厌氧菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属数，显著降低粪便中大肠杆菌和盲肠梭菌属数，但0.1%噬菌体和0.34%氧化锌在调节仔猪粪便微生物组成方面并没有互作效应。Hosseindoust等[20]报道，相比对照组，饲粮中添加0.1%噬菌体显著提高断奶仔猪回肠中总厌氧菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属数，而显著降低回肠中大肠杆菌和盲肠梭菌属数，且0.1%噬菌体组仔猪回肠和盲肠微生物组成与0.2%有机酸组间无显著差异。而与0.34%氧化锌组相比，0.1%噬菌体组仔猪回肠大肠杆菌属和盲肠梭菌属数均显著降低。Zeng等[18]首次采用16S rDNA测序技术研究了无抗饲粮中添加噬菌体对断奶仔猪肠道微生物组成的影响，结果发现仔猪盲肠微生物群以厚壁菌门和拟杆菌门为主，其次为变形菌门和软质菌门，噬菌体组比抗生素组多28个类群，400 mg/kg噬菌体增加拟杆菌属6个类群、厚壁菌属2个类群和变形菌门1个类群；与对照组相比，600 mg/kg噬菌体增加仔猪盲肠微生物中厚壁菌属5个类群，拟杆菌属5个类群，螺旋体5个类群和变形杆菌门1个类群。总的来说，噬菌体通过靶向或非靶向调节仔猪肠道菌群，尤其是靶向病原微生物，如大肠杆菌和沙门氏菌，从而在仔猪生产中缓解仔猪腹泻和替代抗生素和氧化锌等方面发挥巨大潜力。

6 小结与展望

综上所述，噬菌体可有效缓解仔猪早期断奶应激，提高仔猪生长性能和养分消化率，并改善仔猪肠道形态和调节仔猪肠道菌群，在治疗仔猪主要病原菌引起的疾病方面有着重要作用，具有替代抗生素、氧化锌和有机酸的巨大潜力。

尽管噬菌体在仔猪生产中有很多优点，但仍存在一些问题不能忽略。首先，噬菌体对低pH较为敏感。其次，温度也会影响噬菌体的作用效果。Smith等[26]报道，一些温度敏感噬菌体的毒力在猪等多数动物体内（37℃左右）有所下降。噬菌体的微胶囊化是现阶段解决上述问题的有效手段。另外，噬菌体抗性的增加也是非常重要的一个问题，阻断噬菌体受体、减少噬菌体核酸进入宿主菌、切割噬菌体遗传物质等[27]，都可降低噬菌体感染效率。这也提示在实际生产过程中要控制添加剂量。此外，噬菌体与有机酸、氧化锌、益生菌组合使用，也可有效改善仔猪生长性能。综上所述，建议使用单一噬菌体时，添加剂量要保持在中等水平，并对噬菌体进行微囊化等保护措施；与其他物质组合使用时，选择正向相互作用最大的物质进行配合。后续研究可重点关注：①噬菌体对不同生长阶段猪的合理添加剂量；②噬菌体与其他添加剂的联合使用及其作用机制等，为合理利用噬菌体提供理论依据，为仔猪生产的发展提供新思路。