葛叶总黄酮的提取工艺优化及抗菌抗氧化能力研究

魏磊 王伟 侯玥莹 谢晓阳 周雍 陈飞 刘雨晴 崔炜 王韬 景炳年

摘要 [目的]优化葛叶总黄酮提取工艺，并分析其抑菌抗氧化活性。[方法]以黄酮类化合物的提取量为响应值，在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间为因素，采用响应面法优化葛叶总黄酮的超声提取工艺。采用二倍稀释法测定葛叶总黄酮对7种常见致病菌的最低抑菌浓度（MIC），以考察其抗菌活性，并通过测定OH-、DPPH和ABTS自由基的清除活性来考察其抗氧化活性。[结果]葛叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度85%，液料比48∶1（mL∶g），超声温度73 ℃，超声时间90 min，验证试验结果表明黄酮提取量为26.38 mg/g，接近理论值;抗菌活性研究结果表明，葛叶总黄酮的最小抑菌浓度为4～32 mg/mL，表明葛叶总黄酮具有较强的广谱抗菌作用;OH-、DPPH和ABTS自由基清除试验IC50分别为1.78、1.58和0.86 mg/mL，表明葛叶总黄酮具有较强的抗氧化活性。[结论]该研究可为葛叶黄酮资源的开发利用提供科学依据。

关键词 葛叶总黄酮;响应面分析;提取优化;抗菌;抗氧化

中图分类号 R 284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）14-0152-05

Abstract [Objective]The objective is to optimize the ultrasonic extraction technology of total flavonoids from  Pueraria lobate  leaves （FPL） and investigate its antibacterial and antioxidant activities. [Method]Using the extraction amount of flavonoids as response value， the ultrasonic extraction technology of FPL was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test with ethanol concentration， liquidsolid ratio， ultrasonic temperature and time as factors. The minimal inhibit concentration （MIC） of FPL on 7 kinds of common pathogens were detected by double broth dilution method， so as to investigate antibacterial activities， and the antioxidant activities were investigated through the measurement of OH-， DPPH， and ABTS scavenging activity. [Result]The results showed optimal ultrasonic extraction technology of FPL included ethanol concentration 85%， liquidsolid ratio 48∶1（mL∶g）， ultrasonic temperature 73 ℃ and time 90 min. Under these conditions， the amount of flavonoids was 26.38 mg/g. Measured value agreed well with predicted value. Results of antibacterial activities study showed that MIC were in the range of 4-32 mg/mL. FPL showed significant antibacterial activities. The IC50 of OH-，DPPH， and ABTS scavenging activity were 1.78， 1.58 and 0.86 mg/mL， respectively. And the scavenging effect has a doseeffect relationship with the concentration of FPL. The optimized ultrasonic extraction technology of FPL is stable and feasible. [Conclusion] The results can provide a scientific basis for the exploitation and utilization of flavonoids resources of  Pueraria lobate  leaves.

Key words Total flavonoids of  Pueraria lobate  leaves;Response surface methodology;Extraction optimization;Antibacterial;Antioxidant

基金項目 河南省科学院基本科研项目（200613024）;河南省科学院科技开放合作项目（200913009）。

作者简介 魏磊（1986—），男，河南新乡人，助理研究员，博士，从事中药化学研究。*通信作者，助理研究员，博士，从事植物化学及分子生物学研究。

收稿日期 2020-11-16;修回日期 2020-12-24

葛（ Pueraria lobate ）为豆科葛属多年生藤本植物，除新疆、青海和西藏以外，分布全国[1]。葛全身是宝，经济价值很高。根入药，有解表退热、生津止渴、升阳止泻的功能[2];叶有收敛止血、消肿止痛等作用，主治创伤出血、跌打损伤[3]。根入药后留下大量的叶，或被丢弃，或用于饲料，浪费或降低了叶的利用价值，尤其是药用价值。目前对葛资源研究开发主要集中于葛根作为中药材的加工利用，而对葛叶的开发利用较少。

葛叶中有多种药效成分，主要活性物质包括葛根素、大豆苷、黄豆苷等黄酮类化合物[4]。目前已有葛叶总黄酮提取工艺和含量测定的相关报道，主要是对乙醇浓度、提取温度及用石油醚预提等条件单独进行初步分析[5]，或是正交试验法优化提取方案，但关于葛叶总黄酮的超声辅助响应面法系统提取方法优化却鲜见报道。此外，葛根及葛花[6]中总黄酮已被证实有抗氧化功效，而葛叶中总黄酮抗氧化活性较少见相关报道。

鉴于黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等广泛的生理及药理活性[7]，响应面法能够对多种影响提取效率的因素及之间相互作用进行有效性系统分析[8]，超声波提取技术具有提取效率高、耗能低、不破坏活性成分的优点[9]，因此响应面法结合超声辅助提取技术在优化黄酮类化合物[10-11]的提取工艺中得到广泛应用。

因此，笔者采用响应面法优化葛叶总黄酮的超声辅助提取工艺，并考察葛叶总黄酮对人体常见致病菌的抑制作用及抗氧化能力，旨在为葛叶总黄酮的进一步研究及葛葉的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛叶采自河南省南阳市南召县，烘干后粉碎过40目筛，备用;人体常见致病菌包括金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希菌ATCC 25922、化脓性链球菌ATCC 19615、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、肺炎链球菌ATCC 49619、铜绿假单胞菌 ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603，购于南京便诊生物科技有限公司;葛根素，购于中国药品生物制品检定所;牛肉浸膏，购于北京双旋微生物培养基制品厂;胰蛋白胨，购于上海宝录生物科技有限公司;96孔板，购于美国Corning公司;OH-、DPPH、ABTS，购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司;亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠等为分析纯，购自北京化工厂;无水三氯化铝为分析纯，购于天津市福晨化学试剂厂。

ME-204型电子天平;KQ-500E型超声波清洗仪;EYELAN-1100型旋转蒸发仪;TU-1810型紫外分光光度计;XMTD-7000型恒温水浴锅;SYQ-DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅;wi93008型麦氏比浊仪;DHP-9082型电热恒温培养箱;YJ-VS-2型超净工作台;Bio-rad iMarkTM型酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 葛叶总黄酮提取流程。

称取1.00 g葛叶粉于100 mL锥形瓶中，以相应液料比加入设定浓度的乙醇溶液，在特定温度下超声提取一定时间，重复提取3次，合并滤液后浓缩定容，取适量测定溶液中总黄酮含量。

1.2.2 总黄酮含量测定。

1.2.2.1 标准曲线绘制。

以葛根素为标准品，采用分光光度法测定总黄酮含量。称取标准品4.00 mg，50%乙醇溶液定容至10 mL容量瓶中。分别准确移取0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mL该溶液于25 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至10 mL，再加入5% NaNO2溶液0.3 mL摇匀后静置10 min，加入10% AlCl3溶液0.3 mL，摇匀后静置10 min，加入5% NaOH溶液4.00 mL，加超纯水至刻度，摇匀，静置15 min，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度（ A ）为纵坐标，以葛根素质量浓度（ C ）为横坐标绘制标准曲线。回归方程为 A=0.012 4C-0.000 7，R2 =1.000 0。说明葛根素标准品在3.2～48.0 μg/mL线性关系良好。

1.2.2.2 总黄酮含量测定。

根据标准曲线的回归方程，计算提取液中总黄酮含量。提取量[mg（总黄酮）/g（干葛叶）]计算公式：

总黄酮提取量=（总黄酮质量浓度×提取液体积×稀释倍数/葛叶质量）×1 000

1.2.3 葛叶提取单因素试验及响应面设计。

选定乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声温度（C）和超声时间（D）作单因素试验，然后进行响应面设计，根据Box-Behnken试验设计原理，采用统计软件Design-Expert 8进行分析，对4因素3水平共29组试验结果分析优化葛叶总黄酮提取方案，试验设计因素水平和结果分别见表1、2。

1.2.4 葛叶总黄酮制备。

用响应面优化的提取方案提取葛叶总黄酮得到乙醇提取液后进行抽滤，浓缩后加入2倍体积的无水乙醇，低温静置过夜以除去大部分多糖，真空冷冻干燥得到葛叶粗黄酮，并将其配置成浓度为256 mg/mL的母液，进行后续活性试验研究。

1.2.5 葛叶总黄酮抑菌作用研究。

1.2.5.1 菌种复苏及菌悬液制备。

上述7种常见致病菌复苏后接种于固体培养基上，37 ℃培养12～24 h，挑取单个菌落混悬于液体培养基中，使用麦氏比浊仪检测菌液浓度，将各菌种制成106～108 CFU/mL的菌悬液。

1.2.5.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的检测。

用微量二倍稀释法测定葛叶总黄酮的MIC。将“1.2.4”中制备的药液过0.22 μm滤膜，用液体培养基依次倍比稀释9个浓度，即128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL;然后依次分别加入96孔板中，每孔100 μL;再分别加入“1.2.5.1”中各种菌悬液，每孔100 μL。每种分别设置阳性对照（只加入100 μL菌液和100 μL液体培养基）和阴性对照（只加200 μL液体培养基）。96孔板于恒温培养箱中37 ℃培养过夜观察结果，MIC为完全没有细菌生长时的最低浓度。将无菌生长的各孔取样，分别涂布于固体培养基上，37 ℃培养24 h观察结果，以平板上无细菌生长的最低药物浓度为MBC。

1.2.6 葛叶总黄酮抗氧化活性研究。

1.2.6.1 OH-自由基清除作用。

向1 mL葛叶总黄酮系列溶液（浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL）中依次滴加2 mL FeSO4（1.6 mmol/L）、3 mL水杨酸-乙醇溶液（1.6 mmol/L）和 2 mL H2O2（1.5 mmol/L），充分混匀，加超纯水定容于10 mL容量瓶中，37 ℃水浴加热反应15 min后于510 nm处测定吸光度。以抗坏血酸和葛根素为阳性对照，超纯水为空白对照。重复测定3次取平均值。清除率公式：

OH-清除率（%）=（1- A1/A2）×100

式中，A1为样品或阳性对照吸光度值;A2 为空白对照吸光度值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除作用。

参照Blois[12]的方法测定。取葛叶总黄酮系列溶液（浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL）100 μL，加入100 μL DPPH（0.2 mmol/L），充分混匀，避光静置30 min后，以抗坏血酸和葛根素为阳性对照，超纯水为空白对照，于波长517 nm处测吸光值。重复测3次取平均值，清除率公式同“1.2.6.1”。

1.2.6.3 ABTS自由基清除作用。

参照Re等[13]的方法测定。反应体系中，系列浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL，以抗坏血酸和葛根素为阳性对照，超纯水为空白对照。重复测3次取平均值，清除率公式同“1.2.6.1”。

2 结果与分析

2.1 单因素考察结果

2.1.1 乙醇浓度。

设定液料比30∶1、超声温度50 ℃、时间50 min，考察不同乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）对葛叶总黄酮提取量的影响，结果见图1。从图1可见，提取量随乙醇浓度的增加而增大，在乙醇浓度80%葛叶总黄酮达到最大值，之后下降明显。这可能是由于葛叶总黄酮极性与80%乙醇相似，故选择80%乙醇为最佳提取浓度。

2.1.2 液料比。

设定乙醇浓度80%、超声温度50 ℃、提取时间50 min，考察不同液料比（10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1）对葛叶总黄酮提取量的影响，结果见图2。由图2可知，随液料比的增大提取量逐渐增大，当液料比大于40∶1，总黄酮提取量增加不明显，本着节约试剂的原则，选择最佳液料比为40∶1。

2.1.3 超声温度。

设定乙醇浓度80%、液料比40∶1、超声时间50 min，考察不同温度（30、40、50、60、65、70、75 ℃）对葛叶总黄酮提取量的影响，结果见图3。由图3可见，65 ℃时提取量最高，之后提取量下降，这可能是由于温度过高会影响黄酮分子结构稳定性而发生了转化或降解，故选择65 ℃为最佳提取温度。

2.1.4 超声时间。

设定液料比40∶1、乙醇浓度80%、超声温度65 ℃，考察不同超声时间（20、40、60、80、100 min）对葛叶总黄酮提取量的影响，结果见图4。由图4可知，提取量随提取时间的延长而增大，80 min达到最大，此后不升反降。这可能是由于超声时间延长，会使黄酮发生一些转化反应，同时杂质溶出也会增加，反而降低了提取量，故选择最佳提取时间为80 min。

2.2 响应面法优化葛叶总黄酮提取工艺

2.2.1 不同因素对提取效果的影响。

采用Design-Expert 8软件对表2的数据进行拟合，得到二次多项回归方程： Y=26.49+2.09A+1.99B+0.79C-2.12D+1.59AB+0.027AC+0.90AD+1.01BC +1.22BD-0.63CD-6.88A2-6.54B2-1.08C2-1.87D2。 方程中各项系数绝对值大小反映各因素对响应值的影响程度，系数的正负反映影响的方向。由方程的二次项系数为负值，推断方程代表的抛物面开口向下，具有极值点，可以进行优化分析。

对拟合模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，回归模型极显著（ P <0.000 1），而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合较好，试验误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

决定系数 R 2和调整决定系数AdjR2分别为0.975 3和0.950 6，说明该模型拟合度良好;预测决定系数PredR2为0.900 4，说明该模型预测性良好。信噪比Adeq Precision为19.864，说明方程的拟合度和可信度较高，试验误差较小。失拟项 P 值0.784 2（ P >0.05），表示所使用的模型与具体试验结果吻合程度高，失拟项不显著。方程中 A、B、D、A2、B2、D2 对响应值影响极显著，乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（D）对提取量影响最显著。

2.2.2 响应面交互作用分析。

从图5可知，响应面均为开口向下的凸形曲线，说明响应值存在极高值，6 个图形的等高线中心均位于-1～1，表明葛叶总黄酮提取最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。响应面坡度陡峭程度可以反映交互效应的强弱，响应面坡度越陡峭，表明响应值对于因素的改变越敏感，反之曲面越平缓表明因素的改变对于响应值的影响越小[14]。图5直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响，乙醇浓度和液料比、液料比和超声时间交互作用曲面陡峭，表明其对葛叶总黄酮提取量的交互作用明显。

2.2.3 最佳条件的确定及验证试验。

用Design-Expert 8软件得出葛叶总黄酮提取最优条件为乙醇浓度84.4%，液料比48.4∶1，超声温度73.4 ℃，超声时间92.8 min。为适合试验操作，调整为乙醇浓度85%，液料比48∶1，超声温度73 ℃，超声时间90 min。重復3次验证试验，平均提取量为26.38 mg/g，达到预测提取量（27.54 mg/g）的95.8%，说明应用响应面法优化得到的葛叶总黄酮超声辅助提取工艺参数可靠，具有一定参考价值，且葛叶黄酮类物质含量较高。

2.3 抑菌试验结果

葛叶总黄酮抑菌试验结果见表4。由表4可知，所选7种常见致病菌的MIC为4～32 mg/mL，MBC为4～64 mg/mL，整体抑菌作用较强，尤其是对鼠伤寒沙门氏菌和化脓性链球菌抑制作用最强，且具有广谱性。

2.4 抗氧化试验结果

通过在波长210、517、734 nm下测定得到的吸光度及相关计算，得到葛叶总黄酮及同浓度抗坏血酸和葛根素分别对OH-、DPPH和ABTS自由基的清除率，结果见图6。从图6可以看出，葛叶总黄酮虽然比抗坏血酸的抗氧化活性弱，但是比葛根素强，且清除能力随总黄酮含量增加而增强，呈现出良好的剂量效应关系。OH-、DPPH和ABTS自由基清除试验IC50分别为1.78、1.58和0.86 mg/mL，表现出较强的抗氧化作用。

3 讨论与结论

联合国粮农组织预言，21世纪葛将成为继水稻、小麦、玉米、马铃薯、甘薯之后的第六大主食[15-16]，而且葛的种植投资少、见效快、风险小、效益高，加之病虫害较少一般不施农药，是较为理想的绿色食品，符合当今推崇保健的潮流[17]。因此，葛资源的深度种植和开发利用日益受到重视。葛的生长期需要掐苗5～6次，产量极其可观，而葛叶中含有较多活性物质，具有广阔的开发研究前景。

该研究在单因素试验的基础上，采用响应面法对葛叶总黄酮的超声辅助提取工艺进行了优化，确定最佳提取工艺条件为乙醇浓度85%，液料比48∶1，超声温度73 ℃，超声时间90 min，在该条件下，葛叶总黄酮提取量为26.38 mg/g，与模型预测的提取量误差较小，说明利用响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠。吴超等[1]采用正交试验对葛叶总黄酮的热水浸泡提取工艺进行了优化，其最佳工艺为提取温度80～100℃，时间为30～40min，溶剂体积为50～60mL，该条件下，总黄酮提取率为1.18%（相当于提取量11.8 mg/g），远低于该试验，其原因除与葛叶的产地、品种及采摘季节等有关外，最主要原因是超声辅助提取的工艺条件不同所致，超声波能增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物成分溶出速度和溶出数量[18]，这说明响应面法结合超声辅助提取工艺是一种更好的优化方法。

该研究葛叶中总黄酮含量较高，且表现出较强的抗菌活性和抗氧化活性，说明在产量及活性方面葛叶黄酮都具有进一步研究开发的价值，可为深入研究葛叶黄酮化合物及提高葛资源综合开发利用提供理论依据。

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