免疫分析技术在农药残留快速检测中的应用及研究进展

郭思依，孙明娜，董 旭，褚 玥，童 舟，王 梅，高同春，段劲生

（安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（合肥），合肥 230031）

0 引言

在农业生产过程中，农药起到预防或消灭病、虫、草及其他有害生物、调节植物生长等作用。然而，若施加不当，不仅会破坏生态环境、危害人类健康，而且长期施加还容易使病虫害产生抗药性。因此，有效监测农药残留并控制在允许范围内，是农产品质量安全控制中至关重要的环节。《GB 2763—2019食品中农药最大残留限量》规定了食品中483种农药的7107项最大残留限量，由此可知被允许的农药残留含量大多处于痕量水平，因此需要较高灵敏度的检测方法。

前人研究表明农产品中农药残留检测的常用方法主要有传统的色谱法和快速检测法。色谱法如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱质谱联用(GC-MS)、液相色谱质谱联用(LC-MS)等方法选择性强，可以实现多残留的同步分离和较低的检出限。但另一方面，该方法对样品前处理过程要求较高，检测时间较长，所需仪器庞大昂贵，不适合大批量样品测定。快速检测法如酶抑制法、活体生物测定法和免疫分析法。酶抑制法较为成熟，不足之处在于其反应过程极易受到环境因素影响，进而影响检测结果；此外，酶抑制法也只对氨基甲酸酯类有机磷农药有效果，这也限制了方法的应用范围。活体生物测定法价格低廉、检测快速，但是需要大量的时间和精力筛选敏感生物，检测稳定性和重复性也较差。

免疫分析是基于抗体、抗原之间的特异性结合实现对目标物定量检测的技术，具有高灵敏度和选择性、简单快速、成本低等优势。为提高农药残留快速检测灵敏度、解决传统方法在快速检测上的不足，开展基于免疫分析法的农药残留快检工作具有重要意义。根据标记物的不同，本研究综述了酶联免疫吸附分析、荧光免疫分析、免疫层析、免疫磁珠、仿生免疫分析及生物条形码技术等，分别介绍探讨了这几种不同的免疫分析技术的优缺点及适用范围，期望为农药残留的实验室和现场检测提供参考。

1 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是将抗原抗体的特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种免疫分析技术。待测物和酶标抗原与固相载体表面的抗体反应产生抗原抗体复合物，酶反应底物被催化为有色产物的量与待测物含量直接相关，可据此进行定性定量分析[1]。

ELISA的检测方法主要有双抗体夹心法、捕获法和竞争法，其中双抗体夹心法和捕获法属于非竞争检测模式，在此模式下，抗体与目标分析物形成复合体，检测信号与目标分析物含量成正相关，通常适用于大分子抗原的检测[2]；而农药作为一类单抗原决定簇的小分子化合物，只能和一个抗体结合，故而通常采用竞争检测模式，检测信号与目标分析物含量成负相关[3]。

ELISA检测技术所具有的高特异性和高灵敏度等优势使其广泛应用于食品分析、农药残留、生物学、医学等领域。在农药残留检测方面，Lan等[4]制备出多杀菌素A的新型单克隆抗体，构建了多杀菌素A间接竞争ELISA(icELISA)法监测牛奶、水果和蔬菜中的多杀菌素残留，方法的半抑制浓度(IC50)和检测下限(LOD,Limit of detection)分别为4.11 ng/mL和0.63 ng/mL。Fang等[5]开发了一种灵敏的生物素化icELISA法检测花粉中的啶虫脒残留，通过抗啶虫脒单克隆抗体的生物素化，进一步提高免疫反应的灵敏度，LOD为这0.17 ng/mL，加标回收率为81.1%～108.0%。Li等[6]提出一种基于适配体的icELISA(apt-ELISA)法测定水胺硫磷残留，适配体具有易合成、易存储等优点，利用适配体模拟抗体快速测定水中的水胺硫磷，显示出较好的的选择性和较高的灵敏度。ELISA技术所具有的快速、灵敏、成本低等优势，使其广泛应用于农药残留检测之中并且日趋成熟，但操作不当和背景干扰等也会带来一定的限制。

2 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法(Fluorescence immunoassay,FIA)是以荧光物质作为标记物，抗原抗体的结合反应导致荧光强度发生变化，以此实现对目标物的定量测定。

2.1 时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved Fluorescence Immunoassay,TRFIA)是利用镧系元素及其螯合剂作为示踪物所建立的一种新型的非放射性微量分析技术。铕(Eu3+)，铽(Tb3+)和钐(Sm3+)具有窄带发射谱线，较大的Stokes位移，高量子产率和长衰变寿命的特性，可以产生强荧光并具有长衰减时间。由于延长了测量时间，并且在短寿命背景荧光衰减之后测定了镧系元素螯合物发射的特异性荧光，因此可以消除背景荧光的干扰。较大的Stokes位移也可以有效地消除来自激发源的干扰。此外，添加荧光增强剂可以使原始荧光增强一百万倍[7-9]。因此，TRFIA通常比ELISA具有较低的背景和更高的灵敏度。

Xu等[10]开发了对一类有机磷农药(Ops)具有广泛特异性的基于单克隆抗体的直接竞争TRFIA法，检测限低于10 ng/mL，环境水样中OPs的加标回收率为74.8%～121.3%，相对标准偏差(RSD)为6.4%～15.1%，方法具有良好的灵敏度，简便性和快速性。Liu等[11]利用Eu3+标记的抗体作为示踪剂建立了快速灵敏的TRFIA法测定噻虫啉，在最佳条件下，TRFIA法的IC50值为2 μg/L，LOD为1.9ng/L，在水、土壤、梨和番茄中的加标回收率为83.4%～121%。由于不同镧系元素荧光螯合物的发射波长不同，TRFIA能够同时测定两种或多种分析物，Shi[12]等建立了双标记TRFIA法同时检测食品和环境基质中的对硫磷和吡虫啉，将Eu3+和Sm3+作为荧光标记分别与抗吡虫啉多克隆抗体、抗对硫磷多克隆抗体偶联，对硫磷和吡虫啉的IC50分别为10.87 μg/L、7.08 μg/L，检出限(IC10)分别为0.025 μg/L、0.028 μg/L。尽管TRFIA的成本比ELISA的成本略高，但其所具有的较低的背景干扰和更高灵敏度使TRFIA技术可以在痕量水平上监测农药残留，保证农产品安全。

2.2 荧光偏振免疫分析

荧光偏振免疫分析法(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)是一种竞争性免疫测定方法，通过检测荧光标记小分子抗原(Tracer)与抗体结合前后荧光偏振值的变化来间接反映目标分析物的含量[13]。对于农药检测，可以将特定的示踪剂与特定的单克隆抗体(mAb)结合，该mAb会诱导高极化值，一旦包含目标农药的样品竞争与mAb的结合，极化值就会迅速减弱。

Liu等[14]基于特定的抗三唑磷单克隆抗体和THBu-EDF荧光示踪剂开发了一种快速，均匀且高通量的用于三唑磷检测的FPIA法，反应时间不到10分钟，检测限为0.29 μg/L，IC50为3.62 μg/L，在水、糙米、卷心菜和苹果样品中的平均加标回收率为72.07%～104.35%。Boroduleva等[15]建立了小麦中噻菌灵和氟醚唑的FPIA法。Xu等[16]利用广谱单克隆抗体开发了一种简单快速、高通量的FPIA法同时测定5种有机磷农药，检测限低于10 ng/mL，加标蔬菜的回收率为71.3%～126.8%。雷红涛等[17]建立了一种置换型荧光偏振免疫技术(DFPIA)检测水样中除草剂丁草胺，所谓置换是将荧光示踪物和抗体预先混合制备出免疫复合物，而后加入分析物，经短时间反应后测定荧光偏振信号，该免疫复合物可在4℃下稳定保存至少一周以上。

由此可见，Tracer合成简单、条件温和、用时短，标记荧光素性质较稳定，过程中无需洗涤，可适用于样品的快速大量筛选。另一方面，与ELISA相比，FPIA的灵敏度较低，原因可能在于样品自身的荧光会对检测产生干扰，而且每种检测物抗原都要有其相应的Tracer，有一定的技术成本。

2.3 量子点荧光免疫分析

量子点(Quantum dots,QDs)是一种半导体纳米晶体，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成，可以接受激发光产生荧光，具有激发光谱宽发射光谱窄，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长等荧光特性，可作为优越的荧光探针[18]。QDs与免疫测定相结合，增强了农药检测的特异性和灵敏度。

Tan等[19]将CsPbBr3QDs嵌入分子印迹聚合物(MIP)中合成MIP/QDs复合材料，其对辛硫磷具有优异的选择性，LOD为1.45 ng/mL，方法用于马铃薯和土壤中辛硫磷的检测，回收率为86.8%～98.2%。Liao等[20]使用CdSe/ZnS量子点作为标记单克隆抗体的探针，建立了用于识别三唑磷的快速、灵敏的荧光免疫测定法。该测定法在10～25 μg/L浓度范围内具有良好线性，IC10为0.508 ng/L，水果样品的加标回收率为82.6%～96.6%。QDs具有宽的激发谱和窄的发射谱，使用同一激发光源就可实现对不同粒径量子点的同步检测，进而实现农药的多重检测。Jiang等[21]以Fe3O4@SiO2@MIP为仿生抗体，不同发射波长的CdSe/ZnS量子点为标记，同时测定水果中的甲基对硫磷，毒死蜱和敌百虫。同样基于CdSe/ZnS量子点具有的不同发射波长，建立了同时测定水果和蔬菜中敌百虫和毒死蜱的直接竞争仿生免疫分析方法[22]。Wang等[23]通过将双量子点与高活性纳米卟啉相结合，实现双纳米信号放大并针对三种有机磷农药产生不同的颜色变化响应，建立了基于荧光可视化的纸质传感器。

通过FIA法测定农药残留具有较宽的线性范围，也能表现出较好的重现性，但检测分析时易受温度、溶剂和散射光等外界因素的影响，对环境因素敏感，因此在应用上存在一定局限性。

3 免疫层析法

免疫层析法(Immunochromatography,ICA)是以层析试纸条为载体，将免疫技术和层析技术相结合的检测方法。试纸条由4个部分组成：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫，样品溶液与结合垫中的标记抗体在毛细管层析作用下，与固定在硝酸纤维素膜上的抗原特异性结合形成免疫复合物，检测线因标记物积累而显色，通过肉眼或仪器判读结果[24]。根据标记物的不同，免疫层析技术大致可以分为胶体金标记技术、量子点标记技术、化学发光材料标记技术、磁性纳米材料标记技术等[25]。

Lan等[26]以胶体金为标记物与广谱单抗结合，制备免疫层析试纸条用于检测水样中的克百威及3-羟基克百威，方法无需复杂的样品前处理并且全过程可在5 min内完成，LOD达7～10 ng/mL。朱亮亮等[27]研制出可同时检测4种有机磷农药的胶体金免疫层析试纸条，验证了试纸条的特异性、准确性和稳定性，为有机磷农药的大批量检测提供了有力的工具。此外，Wu等[28]基于CdSe/ZnS量子点的侧流层析试纸条快速直观地检测草莓中的苯噻菌酯残留，可实现加标样品的多浓度检测和在紫外灯下的结果可视化，检测限为25 μg/L。Yang等[29]设计一种双读数信号探针的新型化学发光免疫层析技术检测甲基对硫磷和甲氰菊酯，LOD分别为0.17 ng/mL和0.10 ng/mL。Li等[30]提出了一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的免疫层析法，用于两种拟除虫菊酯农药氯氰菊酯和氰戊菊酯的双重检测，与抗体偶联的金纳米颗粒(AuNPs)作为SERS底物，通过固定两条设计用于检测两种农药的测试线，可以实现同时双重检测。

ICA法快速直观，同时试纸条体积小、便于携带，这些优点使其适用于农药残留的现场快速检测。当农产品经过试纸条的初筛后，接近或超过残留限量的样品可用更精确的仪器方法进一步测定。因此，ICA加快了检测进程，提高了检测效率。

4 免疫磁珠法

免疫磁珠(Immune Magnetic Beads,IMB)由磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)和免疫配基组成（图1），其中MNPs主要由Fe2O3、Fe3O4等过渡金属氧化物构成且粒径在纳米至微米水平，外部的免疫配基主要是羟基(-OH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)等，可以使磁珠与抗体、蛋白质等生物活性物质共价结合[31]。IMB具有超顺磁性、较大的比表面积可提供较强的吸附能力[32]，通过结合酶、金或荧光染料等标记物，可实现分离检测一体化，具有广泛的发展前景。

图1 免疫磁珠的结构

Du等[33]开发了一种基于免疫磁珠的酶联免疫吸附测定法(IMB-ELISA)，使用羧基功能化的磁性Fe3O4纳米粒子(CMNPs)检测三唑磷，与经典ELISA相比，显著提高了灵敏度，检出限为0.10 ng/mL，在水果、蔬菜、谷物中的平均回收率为83.1%～115.9%，RSD小于10%。崔涵雨等[34]采用一步水热法制备出氨基功能化的Fe3O4磁纳米粒子，并以戊二醛为交联剂与西维因多克隆抗体偶联，采用直接法定量检测西维因含量，测得的IC50为0.077 mg/L，IC15为1.48 μg/L。刘运清等[35]将羧基化磁珠与检测抗原共价结合制备磁珠探针，建立基于TMB2+蚀刻金纳米棒介导的免疫磁珠ELISA检测方法用于检测甲基对硫磷、杀螟硫磷和倍硫磷3种有机磷农药。

IMB提供了大小适当、分散性好、磁化强度高的固相载体免疫反应场所，但在制备过程中也有一些诸如产量低、易团聚等瓶颈。因此，在进一步的研究工作中，可以探索磁珠合成的新方法，提高磁珠表面功能化和配体的富集效率，提高磁珠生物相容性以扩大应用范围。

5 仿生免疫分析法

仿生免疫分析是将分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer,MIP)作为仿生抗体，标记抗原和目标物质竞争性结合MIP洗脱后留下的特异性孔穴，通过检测与孔穴结合的探针物质的量来确定目标物的含量[36]，MIP的制备过程如图2所示。MIP与生物抗体相比，具有良好的物理、化学稳定性，可重复使用且成本低、易制备。目前该技术已广泛应用到磺酰脲类、有机磷类及植物生长调节剂等检测中，并取得了很好的效果。

图2 MIP制备示意图

Zhang等[37]在微流控纸芯片上沉积CdTe得到paper@QDs@MIPs，通过电子转移诱导的荧光猝灭机理对农药2,4-D进行特异性识别和灵敏检测，2,4-D的结合使荧光强度在不到18min的时间内显著降低，并且在0.83～100 μM的范围线性良好，在豆芽中的加标回收率为94.2%～107.0%。Li等[38]建立了毛细管电泳-仿生免疫技术法检测敌百虫，方法灵敏度(IC50)为0.16 mg/L，检出限(IC15)为 0.13 μg/L。Tang 等[39]基于MIP膜作为抗体模拟物，开发了一种新型且快速直接竞争的仿生ELISA(cd-BELISA)，用于测定N-甲基氨基甲酸酯杀虫剂灭多威。洪思慧等[40]以三唑酮为模板，甲基丙烯酸为功能单体，在96孔板表面合成MIP膜，采用仿生酶联免疫分析法检测三唑磷。任蕾[41]采用本体聚合法直接合成了苯磺隆MIP膜并建立仿生酶联免疫分析方法，在最佳条件下，方法的IC50为15.77 μg/L，IC15为0.01 μg/L。

以模板分子合成的MIP不仅在高温高压、酸碱性等条件下稳定性好，而且可以一次合成多次使用，与传统免疫方法相比基质效应较小，抗干扰性强，在痕量的农药残留分析等多个领域表现出良好的应用前景。但目前对分子识别和作用机理等有待更深一步的研究，同时可以拓展MIP在水溶液或极性溶剂中的应用以及在功能单体、交联剂种类和聚合方法方面的创新。

6 生物条形码免疫分析法

生物条形码技术(bio-barcode assay,BCA)是基于两种功能化的纳米粒子，金纳米颗粒(AuNPs)上修饰有抗体和DNA以捕获目标物，磁纳米颗粒(MNP)用于目标物的分离，通过对解离下来的DNA进行信号放大完成检测[42]。BCA技术多用于检测病毒[43]、致病菌[44]、生物毒素[45]及核酸[46]等大分子物质，在体系中可形成AuNPs-目标物-MNP三明治结构复合体，释放DNA后间接测定目标物含量[47]。对于农药等小分子物质而言，无法形成三明治夹心结构，国内外关于BCA应用于农药残留检测的报道也很少。

Du等[48]建立了基于微孔板银染的BCA技术快速测定蔬菜中的三唑磷农药残留，结合生物素亲和素系统，加入银染增强液，在酶标板上通过银染信号的放大作用实现对解离DNA的定量测定。崔雪妍等[49]将毒死蜱半抗原与鸡卵清白蛋白结合后偶联到MNP上，待测物与半抗原竞争结合AuNPs上的抗体，将DNA解离下来后通过实时荧光定量PCR法检测，DNA相对量与待检农药的含量成负相关，方法的LOD为0.27 μg/L，在苹果和梨中平均添加回收率为79%～90%；在此基础上，崔雪妍等[50]又设计合成了三唑磷、对硫磷及毒死蜱三种农药的胶体金纳米探针，建立了基于微滴式数字PCR(ddPCR)的有机磷农药多残留BCA法，ddPCR是一种绝对定量的检测技术，与PCR相比具有更高的准确度。

由于纳米金较大的比表面积，可标记大量的DNA序列，同时，利用高灵敏度的信号放大技术对释放的DNA序列进行定量，保证了BCA法的超高灵敏度。根据目标物的不同，BCA法可设置不同序列的DNA进而实现多种目标物的分析。然而，将抗体标记在DNA片段上的过程较难实现且抗体捕捉抗原的速度较慢，导致反应时间加长，影响了检测的灵敏度；条形码DNA通过PCR扩增也要依赖于昂贵的设备。因此，探索最佳反应条件、进一步简化操作步骤、降低检测成本、提高灵敏度以及开发商业化免疫试剂盒成为未来研究的重要方向。

7 结论

免疫分析技术是以抗原抗体间特异性结合为基础的，常用的酶联免疫吸附测定法具有较好的准确性和重复性，但检测过程中仍需大量的孵育时间；荧光免疫分析以荧光物质作为标记，检测过程中对环境因素敏感。与传统的96孔板固相载体不同，免疫层析试纸条具有体积小、便于携带、快速直观等优点，非常适合农药残留的现场快速检测工作，但灵敏度和精确度普遍较低，大多用于半定量及定性检测；免疫磁珠具有分散性好、磁化强度高的特点，为避免合成的磁珠产量低、易团聚的缺点，可以探索合成新方法，提高磁珠表面功能化和配体的富集效率，提高磁珠生物相容性以扩大应用范围。而随着分子印迹技术、基因检测技术的快速发展，仿生免疫分析和生物条形码技术应用而生。总之，实现快速、灵敏的农药多残留检测将成为免疫分析方法开发的趋势。