广州市鸡肉中科瓦利斯沙门菌的耐药性及分子分型研究

刘海霞 ， 邬雨倩 ， 詹泽强 ， 黄雪欢 ， 瞿孝云 ， 马叶本 ， 叶存栋 ， 廖 明 ， 张建民

(1.广东农工商职业技术学院热带农林学院 ， 广东 广州 511365 ； 2.华南农业大学兽医学院 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室 农业农村部人畜共患病重点实验室 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室 ， 广东 广州 510642)

沙门菌(Salmonella)是一种寄生在肠道的革兰阴性菌，在国内是引起细菌性食源性疾病的主要病原菌。据美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)数据显示，沙门菌每年造成美国大约120万人感染患病，超过400人死亡[1]。在我国每年大概有3亿人因沙门菌感染而患病，占我国病原菌型食源性疾病总数的70%～80%[2]。肠炎和鼠伤寒沙门菌是造成人源感染和食品污染的沙门菌中的优势血清型[3]。科瓦利斯沙门菌(Salmonellacorvallis)在过去比较少见，但近几年逐渐成为优势血清型之一。2016年，廖兴广等[4]发现科瓦利斯血清型在河南省市售生禽肉中成为优势菌型。2018年，Zhang等[5]对广东省农贸市场畜禽肉中的沙门菌分离鉴定的检测数据表明，鸡肉中共鉴定出27种血清型，其中科瓦利斯血清型排名第二。门诊腹泻病例监测中，科瓦利斯沙门菌感染比例逐年上升[6]。禽类在养殖过程中，由于自身特点极易受到沙门菌的感染，所以禽类成为沙门菌食源性疾病的重要传染源[7]。广州市作为鸡肉的消费和生产大市，鸡肉产品的供应和安全性直接关系到人民群众的健康和社会稳定。但目前，有关鸡肉中科瓦利斯沙门菌的相关报道较少，缺乏相关的数据和信息。

因此，本试验通过药敏试验、耐药基因携带情况及脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分子分型等试验方法，探究广州市农贸市场所售的鸡肉中科瓦利斯沙门菌的分子流行病学特征，为鸡肉中科瓦利斯沙门菌的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 21株科瓦利斯沙门菌分离于2016年5—7月广州市农贸市场的现屠宰生鲜鸡档口样品。大肠埃希菌质控菌株ATCC25922和标准菌株H9812均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和培养基 药敏纸片，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、缓冲蛋白胨水(BPW)和氯化镁-孔雀绿(RVS)增菌液，均购自美国Becton公司；MH琼脂、LB琼脂培养基和麦康凯培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；沙门菌属诊断血清，购自S&A公司；PFGE专用琼脂糖(SeaKem gold agarose)，购自美国Bio-Rad公司；细胞裂解缓冲液(Cell lysis buffer,CLB)、细胞悬浮缓冲液(Cell suspension buffer, CSB)、0.5×TBE电泳缓冲液、TE缓冲液、蛋白酶K缓冲液、Gelred染色液、蛋白酶K、限制性内切酶XbaI、DNA marker DL1 000、rTaqDNA聚合酶(PremixTaq)，均购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 琼脂稀释法测定科瓦利斯沙门菌的药物敏感性 采用琼脂稀释法对21株科瓦利斯沙门菌进行14种临床常用抗菌药的药物敏感性试验，药敏测定过程中的质控菌株选择由实验室保存的大肠埃希菌ATCC25922，测定最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)值，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准[8]对结果进行判读。

1.2.2 多重耐药科瓦利斯沙门菌耐药基因的PCR检测 制备DNA模板，对DNA模板进行扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性7 min，94 ℃变性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。扩增后产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，将 PCR结果送往广州艾基生物技术有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST比对，确定突变点和突变种类。具体信息参照表1、表2，引物合成参照文献[9]。

表1 喹诺酮类耐药决定区(QRDR)基因的PCR扩增序列Table 1 PCR amplification sequences of quinolone resistantce determination zone (QRDR) genes

表2 质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因的PCR检测序列Table 2 PCR detection sequences of plasmid mediated quinolone resistant (PMQR) genes

1.2.3 PFGE分子分型 PFGE标准化分型方法参照文献[9]进行,沙门菌地方菌株及标准菌株H9812(Marker)的分型检测步骤包括“制样、包埋、裂解、洗涤、酶切、加样、电泳、染色、读胶”。

2 结果

2.1 药敏试验 根据药敏试验的判定结果可知：21株 科瓦利斯沙门菌对磺胺异噁唑(95.2%)耐药率最高，其次为萘啶酸(90.5%),然后依次为四环素(66.7%)、氟苯尼考(61.9%)、氯霉素(52.4%)、链霉素(28.6%)、环丙沙星(19.0%)、氨苄西林(9.5%)，对头孢噻肟、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、多黏菌素B完全敏感，对亚胺培南的敏感性为90.5%，见表3。

表3 21株科瓦利斯沙门菌药敏试验结果Table 3 Results of drug susceptibility test of 21 Salmonella corvallis (%)

2.2 科瓦利斯沙门菌的多重耐药情况 基于21株科瓦利斯沙门菌的药敏结果得出多重耐药情况，通过计算得到21株科瓦利斯沙门菌中多重耐药菌检出率为81%(耐3类及其以上的抗菌药)，6株(28.6%)可抗1～3种抗菌药，15株(71.4%)可抗4～7种抗菌药。耐药种数最多有7种，耐药谱为SUL+NA+FFC+C+TE+STR最多(28.6%)，其次是SUL+NA+FFC+C(14.3%)、SUL+NA+FFC+TE (9.5%)、SUL+NA+CIP+TE(9.5%)、AMP+SUL+NA+CIP+FFC+C+TE(4.8%)，见表4。

表4 21株科瓦利斯沙门菌多重耐药情况Table 4 Multidrug resistance of 21 strains of Salmonella corvallis

2.3 喹诺酮类耐药决定区(QRDR)与质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因的测定 21株科瓦利斯沙门菌都存在parC突变，第57位氨基酸苏氨酸突变为丝氨酸(Thr57→Ser)，并且在质粒中检出了qnrS、aac(6′)-Ib-cr和qnrB，检出率分别为90.5%、23.8%和9.5%，见表6。分析存在QRDRparC单突变同时携带PMQR对环丙沙星和萘啶酸耐药性影响，结果显示，所有parC氨基酸突变菌株中，不携带PMQR和携带2个PMQR的菌株对CIP不存在耐药性，携带1个 和3个PMQR的CIP耐药菌株分别占75%和25%。不携带PMQR的菌株对NAL不存在耐药性，携带PMQR的菌株对NAL都耐药。见表5。

表5 21株科瓦利斯沙门菌耐药情况与基因检测情况Table 5 Drug resistance and gene testing of 21 strains of Salmonella corvallis

2.4 多重耐药科瓦利斯沙门菌PFGE分型 21株科瓦利斯沙门菌经PFGE分型后,结果显示其可分为7个血清型，5个基因簇分别是C簇、D簇、E簇、F簇和G簇，分别包含菌株数为2株、11株、2株、2株 和2株。C簇2株菌含有1个基因型，D簇11株菌含有6个基因型，E簇2株菌含有2个基因型，F簇 2株菌含有2个基因型，G簇2株菌含有2个基因型。2个单一的基因型分别是A型和B型，仅包含了1株菌(图1)。在基因簇中优势基因簇是D簇。 试验结果显示，编号为25、257和37这3个菌株分别来自广州市白云区、越秀区和海珠区3个不同区域，但同源性100%。

图1 科瓦利斯沙门菌PFGE分型结果Fig.1 The result of Salmonella corvallis PFGE typing

3 讨论

沙门菌广泛存在于动物体本身、动物养殖环境和动物性食品中，在国内是引起细菌性食源性疾病的主要病原菌。我国70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门菌引起的[10]。科瓦利斯这个血清型在过去比较少见，在国外，Dickinson最早于1949年从感染肠炎的家禽的盲肠内容物中分离出科瓦利斯沙门菌[11]；在国内，2012年刘杰等[12]首次在肉鸡养殖和屠宰加工环节分离到该型菌株。但是近几年科瓦利斯逐渐成为优势血清型[4]，因此需要加强对流行菌株的监测。通过对21株科瓦利斯沙门菌进行药敏试验，发现其对磺胺类、四环素类、氯霉素类药物耐药严重，这与国内外有关报道基本一致[13-14]，由此推测可能在长期的畜禽养殖中，这些传统抗菌药物长期以来被广泛应用和不规范的用药方法有密切关系。喹诺酮类作为目前临床上治疗沙门菌感染的一线药物[15]，具有较好的治疗效果，可本试验结果显示，分离株中已出现对喹诺酮类药物的耐药菌株，对环丙沙星、萘啶酸的耐药率分别为19%和90.5%。但分离株对头孢类、多黏菌素B和亚胺培南都不耐药，与以往的研究报告结果相一致[16]。本次试验的菌株多重耐药菌检出率达81%，耐药谱型繁多，多重耐药株的主要耐药表型为SUL+NA+FFC+C+TE+STR。结果表明，广州地区肉鸡沙门菌耐药情况比较严重，提示在畜禽养殖生产中要科学合理地使用抗菌药物。

沙门菌对喹诺酮类药物的耐药性主要与其细胞中喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的parC和gyrA基因突变和质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因有关[9]。本试验中，通过对QRDR基因的检测，所有的菌株在parC基因上都发生了第57位氨基酸苏氨酸突变为丝氨酸(Thr57→Ser)，QRDR突变结果与菌株对萘啶酸的耐药率均为90.5%，结果具有一致性。有研究表明，基因parC的QRDR中的点突变可以减少对喹诺酮类的易感性[17-18]。PMQR被认为可通过外排泵等机制介导细菌对喹诺酮类药物的耐药[19]，试验中携带PMQR基因[qnrS、aac(6′)-Ib-cr、qnrB]的菌株对NAL都耐药。以上结果表明，QRDRparC单突变菌株携带PMQR基因与沙门菌对萘啶酸耐药之间存在一定的联系，PMQR基因可增强菌株对喹诺酮类药物的耐药性。

目前PFGE是国内外常用的分子分型及溯源技术，本试验的21株科瓦利斯沙门菌PFGE分子分型分为7个血清型，呈现遗传多样性。超过一半的菌株分布在D簇，说明D簇是1个优势基因簇，D簇菌株25、257、37来源于同一采样市不同采样点，但带型相似度却达到了100%，提示肉鸡间可能存在共同来源或者交叉污染，若存在共同来源，本次试验的样本可能来源于同一养殖场；若存在交叉污染，则需要加强卫生管理和污染监测，降低食源致病菌污染，减少食源性致病菌的发生。

本试验结果表明，广州市各大农贸市场肉鸡中科瓦利斯沙门菌高耐药性，多重耐药严重，喹诺酮耐药决定区基因(QRDR)普遍存在parC突变，PFGE 分子型别呈多态性,有同源菌株的存在,提示存在共同来源或者交叉污染，提示为降低沙门菌引起的食品安全风险，应加强市场卫生管理以及重视养殖场沙门菌的净化工作。