无菌接产培育 SPF 级比格犬

王 旭 ， 王可洲 ， 胡 军 ， 李方正 ， 王冬冬 ， 郭中坤 ， 雷 战 ， 杨宗统 ， 齐昊南 ， 原昆鹏 ， 齐佳欣 ， 胡静雷 ， 时启琳 ， 尹 月 ， 王建琳 ， 尹燕博

(1. 青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ； 2. 山东省实验动物中心 ， 山东 济南 250002 ； 3. 上海农林职业技术学院 ， 上海 杨浦 201699 ； 4. 青岛博隆实验动物有限公司 ， 山东 青岛 266200 ； 5. 山东省中医药研究院 ， 山东 济南 250031 ； 6.延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133000)

无特定病原(Specific pathogen free,SPF)犬是指除普通级实验犬应排除的病原外，还不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验犬，是生物医学特别是兽医学研究的重要基础支撑。1946年，Glimstedt 首次培育成无菌犬，随后 Reece 等在 1968年培育并建立了SPF犬种群[1]。1992年，上海医科大学实验动物部利用剖腹产技术培育出6只 SPF 级比格犬[2]，此后未见相关报道。到目前为止，我国尚无SPF犬核心种群，未能实现 SPF 级实验用比格犬的持续、批量生产。本研究参照培育 SPF 猪所用的无菌接产技术，获得仔犬转移至无菌隔离器继续饲养，成功培育出3批共128 只 SPF 级比格犬。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级种母比格犬24只，年龄2～6岁， 来源于青岛博隆实验动物有限公司[SCXK(鲁)20170006]。实验犬饲养在青岛博隆实验动物有限公司 SPF 动物房内[SYXK(鲁)20180026]，温度：23～25 ℃，湿度：50%～65%，12 h 光照 12 h 黑暗。所有操作均符合实验动物福利要求，并给予实验动物人道关怀。

1.2 试剂、物品与仪器 犬细小病毒抗体(CPV-Ab)、犬瘟热病毒抗体(CDV-Ab)、犬腺病毒抗体(CAV-Ab)、犬冠状病毒抗体(CCV-Ab)、犬副流感病毒抗体(CPIV-Ab)、犬疱疹病毒抗体(CHV-Ab)ELISA 检测试剂盒，均购自美国 XpressBio 公司；狂犬病毒抗体(RV-Ab)、弓形虫抗体(TOX-Ab)ELISA 检测试剂盒，均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；钩端螺旋体抗体(LEP-Ab)ELISA 抗体检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；布鲁氏菌试管凝集抗原，购自中国疾病预防控制中心。HT-1505A 型正压隔离器为深圳市泓腾生物科技有限公司产品；LDZM-80L-Ⅲ型高压蒸汽灭菌器为上海申安医疗器械厂产品。复合微生物 B 粉、维生素 C 粉为济南新星饲料有限公司产品；全价配方奶粉为美国PetAg 公司产品。

1.3 种犬选择、病原微生物检测及孕期管理 种犬的选择标准：备选种犬遗传背景清楚，母犬年龄2～6岁，公犬年龄2～7岁，中小体型，无难产史。历史平均窝产仔数不少于 6 只，且健康成活。通过检测，不携带《实验动物 微生物学等级及监测》(GB 14922.2—2011)和《实验动物 寄生虫学等级及监测》(GB 14922.1—2001)中规定的病原[3-4]，临床健康且品相较好。

种犬采用硕腾公司生产的卫佳捌®疫苗进行免疫，通过自然交配进行配种，种母犬转入屏障环境之前检测病原。检测合格的种母犬怀孕后，转到经过彻底消毒的栏舍单独饲养，并保持严格消毒。预产期前5天，转移至屏障环境中适应环境。

1.4 隔离器、屏障环境及用具消毒 由青岛博隆实验动物有限公司与深圳市泓腾生物科技有限公司联合研制的新型 SPF 犬专用饲养隔离器，为双箱体构造，每个箱体可饲养 4～8 只幼犬，且箱体之间互不连通。隔离器上、下连接部分采用水封的方式密闭，内置网床、料盆，四周带有长臂软质胶手套。使用前先清洁各组件，按照正确的顺序组装隔离器。采用甲醛高锰酸钾熏蒸方式对隔离器及屏障环境进行消毒，消毒之前先对隔离器的密闭性进行检查[5]。将所需物品全部放入屏障环境后，每立方米用甲醛42 mL、高锰酸钾21 g混匀熏蒸24 h后通风3 d备用[6]。保温转运箱用1%过氧乙酸溶液喷雾消毒60 min，奶瓶、料盆、手套、洗耳球、手术剪等用2%过氧乙酸浸泡消毒30 min后通风24 h备用[7]。所需垫布和衣物等经121 ℃、110 kPa高压灭菌20 min后烘干备用。

1.5 无菌接产 母犬转入屏障环境之前，用0.2%新洁尔灭对其进行全身清洗消毒。母犬转移到屏障环境后每天用1%聚维酮碘带犬消毒栏舍1次。母犬有分娩预兆前再次对母犬进行消毒，尤其注意会阴部及后躯、口腔消毒。用开殖器打开母犬阴道，再用麦氏钳夹住经0.1%新洁尔灭浸泡过的海棉反复几次消毒阴道。用硫酸卡那霉素喷鼻，每侧鼻孔3 mL[8]。接产人员事先用消毒液浸泡双手，待母犬分娩时迅速将仔犬放置在消毒好的垫巾上，用洗耳球吸出仔犬口腔及鼻腔内液体并结扎、消毒脐带，随后将仔犬浸泡在 0.1%新洁尔灭溶液中浸泡消毒。仔犬消毒体表后用灭菌垫布擦干，涂布接生粉后即放入保温转运箱中并尽快通过气闸转移到无菌隔离器中[9-11]，每个隔离器饲养 4～8 只，不同母犬所生仔犬不能混合放置。

1.6 仔犬的饲养管理 隔离器内温度第1周为34～35 ℃， 以后每周降低 2 ℃，到 24～26 ℃为止[12]。隔离器内压力维持在 100～120 Pa,湿度在 40%～70%，换气次数为30次/h。采用全人工哺乳的方式喂养仔犬，奶粉浓度按照说明书调配。仔犬自出生6 h后开始哺乳，哺乳量根据仔犬的食欲及腹围确定，不能喂至全饱。仔犬不同日龄每日哺乳次数及哺乳量见表1。哺乳期内每次哺乳后用灭菌棉球擦拭犬的肛门及外阴，促使其排便、排尿，并且每日称重，测量体长。仔犬 30 日龄开始饲喂高压灭菌的全价颗粒犬粮，饲喂时将犬粮捣碎并配合适量复合维生素 B 及维生素 C。仔犬 35 日龄开始断奶，之后每日饲喂 4 次，同时给予煮沸灭菌的温水。仔犬饲喂过程严格按照程序操作，饲喂结束后对传递仓、奶瓶等物品进行消毒，切断病原传播途径，确保仔犬健康成活。

表1 SPF 仔犬不同日龄哺乳次数及每次哺乳量Table 1 Breastfeeding frequency and breastfeeding volume of SPF puppies at different ages

1.7 病原检测种类及方法 除《实验动物 微生物学等级及监测》(GB 14922.2—2011)和《实验动物 寄生虫学等级及监测》(GB 14922.1—2001)中规定的 SPF 犬需净化的15种病原之外[3-4]，对规模化养殖犬厂危害较大的犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、支气管败血波氏杆菌进行检测。

采集24只所选种母犬的毛发、粪便拭子及口鼻拭子，无菌采集种母犬血清。于仔犬 2月龄时采集毛发、粪便拭子及口鼻拭子，无菌采集仔犬血清[2]。将待检样本送至山东省实验动物中心，按照《实验动物 微生物学等级及监测》(GB 14922.2—2011)和《实验动物 寄生虫学等级及监测》(GB 14922.1—2001)中规定的检测方法进行检测[3-4]，对于国标规定之外的病原自行检测。病原检测方法见表2。病毒检测引物见表3。

表2 SPF 仔犬和种母犬病原及抗体检测方法Table 2 Pathogens and antibody detection methods of SPF puppies and breeding dogs

表3 病毒检测引物Table 3 Primers for virus detection

2 结果

2.1 种母犬及SPF犬病原检测 对符合标准的24只 种母犬进行无菌接产，共获得仔犬 141 只，1月龄仔犬成活个数为 128 只，成活率为 90.78%。种母犬及仔犬病原检测结果均为阴性，见表4。

表4 种母犬及 SPF 仔犬抗原检测结果Table 4 Pathogen test results of breeding female dogs and SPF puppies

2.2 隔离器饲养与普通饲养比格犬生长指标对比分析 分别测量 20 只普通环境饲养的与128只无菌接产隔离器饲养的比格犬 0、10、20、30、40、50、60日龄 生长发育各项指标，结果如表5所示。

表5 隔离器饲养与普通饲养的比格犬生长指标对比Table 5 Comparison of growth indicators of beagle dogs fed in isolators and in ordinary environment

3 讨论

早在 20 世纪 60年代，人们就普遍认识到 SPF 动物对于生物医学研究的重要性[20]，美国、日本、荷兰等国家先后培育出 SPF 犬核心种群[21-23]。我国 SPF 犬培育工作起步较晚，直到 1992年才开始探索[2]。目前国际上获得初代 SPF 犬的方法，仅见剖腹取胎法。而初代SPF 猪的获取方法，则有自然分娩、早期隔离式断奶技术(SEW)、子宫切开、子宫切除、胚胎移植、无菌接产等[11,24]。自然分娩和早期隔离式断奶方式操作简单，对母犬损伤小，但是不能完全切断来自母犬的污染。子宫切开、子宫切除可以较好地控制来自环境和母犬的污染，但是对母犬损伤太大，不符合动物福利要求，且切除子宫的母犬不能再利用，成本较高。无菌接产法操作相对简单，对母犬损伤小，且母犬可以重复利用，更加符合动物福利要求。无菌接产操作过程需注意以下两点：一是母犬分娩的时间不易准确判断，一旦接产人员错过接产时间，母犬所产仔犬则不能利用;二是母犬产程较长，对母犬和屏障环境的消毒及接产人员素质要求较高。一旦消毒不彻底，容易造成来自环境和母犬的污染。本研究最终选择无菌接产方式获得 SPF 仔犬。研究结果表明，无菌接产隔离饲养的比格犬可以排除国标规定的15种病原，以及犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、支气管败血波氏杆菌等本研究项目规定的病原。

SPF级动物生产过程中，质量控制最为关键。本研究采用新型研制的 SPF 犬专用饲养隔离器，隔离器内各项参数由电脑自动监控。隔离器外部亦为屏障环境，其建造要求和参数符合GB50447—2008《实验动物设施建设技术规范》及 GBl4925—2010《实验动物环境及设施》的规定[25-26]。设施设备启用前进行严格的消毒，检测合格之后方可投入使用。日常生产管理中需要建立、健全各项管理制度和操作规程，进入设施内物品须严格消毒，定期对内外屏障环境进行消毒。此外，还要对动物定期进行检测，及时淘汰病原或抗体阳性犬只。

仔犬的生长发育与生产方式、乳品质量、断奶日龄、饲养管理、饲料营养成分、生活环境等诸多因素有关。本研究通过无菌接产获得仔犬，由于缺乏初乳及哺乳时间较长，加之仔犬生活在洁净环境中，难以建立起普通环境中的肠道菌群，导致SPF仔犬生长发育各项指标均低于普通环境下饲养的仔犬。此外，SPF仔犬生活空间狭小，缺乏有效的锻炼，这也是其较之普通环境下饲养的仔犬体型小的原因。

目前为止，我国尚无一家单位可稳定、批量提供SPF级比格犬，这种状况严重影响了犬疫病研究、疫苗研发及评价工作，对人兽共患病的防制极为不利。本研究通过对母犬进行高强度免疫净化病原，通过无菌接产获得SPF仔犬，将其饲养在正压屏障系统中的无菌隔离器中，同时对环境、用具、饲料、饮水等进行严格的控制。病原及抗体检测结果表明，本方法生产的SPF仔犬，完全达到并优于国标要求，可用于SPF犬的批量生产及SPF犬核心种群的建立。本研究所建立的配套技术及生产的产品，不仅为我国重大动物疫病防控所急需，还将在人类医学研究特别是新药研发中得到广泛应用。