液相色谱-串联质谱法探索浅暗化型家蚕的发生原因

张 彦 张 勇 秦 凤 石 凉 童晓琪 黄 浩 黄德辉( 安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 3006; 六安市金安区农产品质量安全中心,安徽六安 37007)

暗化型家蚕自发现以来，就因其全龄期表现黑化表型而备受瞩目，特别是其蛾期全身包括蛾翅在内均呈黑褐色，明显地区别于普通蚕蛾的白色或淡黄色，家蚕育种专家利用这一特点培育出黑白分明的双亲，把家蚕一代杂交种的杂交率提高到99%以上，从而在显著提高家蚕一代杂交种质量的同时，大幅减少了蚕种场剔除纯对、保持杂交率方面的用工[1-4]。安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕育种组工作人员在对暗化型品系580进行选育的过程中，发现了幼虫期头、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等发育阶段体色均比正常暗化型家蚕着色较浅的群体——浅580。通过观察统计580与浅580家蚕个体除在着色上有差别以外，在虫体形态、眠起时间、虫蛹率等生理方面并没有差别，并通过对家蚕品系浅580做遗传调查后发现浅暗化型突变与暗化型突变一样，相对于普通白蛾表型为隐性遗传[5]。

进一步研究发现，家蚕浅暗化型突变品系浅580第7天蛹体内暗化突变基因BmiAANAT(mln)与黑色素代谢通路上另一条表达产物同样具有催化多巴胺功能的基因BmiAANAT2的表达量相对于家蚕暗化型突变品系580均大幅下调，并推测该变化是引起浅580发生的主要原因[5]。为验证该推测并进一步揭示浅暗化型家蚕的发生机理，增强对家蚕黑色素代谢调控机制的认识，本研究设计了通过利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析580及浅580第8天蛹体内多巴和多巴胺等黑色素前体物质含量变化的试验。现将有关情况报告如下，供同仁参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试家蚕 暗化型家蚕品系580、浅暗化型家蚕品系浅580，均由安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕育种组培育，在适宜条件下饲养、上蔟、结茧、化蛹，蛹期第8天时，用纯水轻柔冲洗，沥干后于-80 ℃ 储存、备用。

1.1.2 主要试剂 左旋多巴(色谱纯，D9628)、盐酸多巴胺(色谱纯，H8502)、乙腈(色谱纯，34851)，均为美国Sigma公司产品；甲酸(色谱纯，85174)，美国Thermo公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 Agilent1290液相色谱仪、SB-PHENYL色谱柱(2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm)、Agilent 6460 LC/MS 液质联用仪，均为安捷伦科技(中国)有限公司产品；JK 3200B超声波清洗器，上海超声波仪器公司产品；BP211D电子天平，德国赛多利斯公司产品；冷冻干燥器，美国热电公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 甲酸溶液的配制 称取0.1 mL甲酸用去离子水溶解并定容至100 mL，配制成体积分数为0.1%的甲酸溶液。

1.2.2 样品的获取及提取 取580及浅580第8天的蚕蛹各20头，分别使用冻干机冷冻干燥，高速粉碎机粉碎并过100目筛。各称取5.0 mg样品，加入5.0 mL甲酸、5.0 mL乙腈和40.0 mL纯水，涡旋1 min，混匀后15 000 r/min离心10 min，取上清液进样。

1.2.3 标准物质溶液的配制 取标准物质储备液，加水分别配制成浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的标准物质溶液，过0.22 μm滤膜，LC-MS/MS分析。

1.2.4 液相及质谱条件 流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，进样体积为10 μL；雾化器温度350 ℃，雾化器流速10 L/min，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min，采集方式为多反应监测(MRM)，条件如表1所示。

表1 多反应监测模式(MRM)参数

2 结果与分析

2.1 多巴和多巴胺标准品及样品的色谱图

如图1和图2所示，图1-A是多巴标准品的色谱图，多巴的保留时间为0.89 min；图1-B是样品的色谱图，分析物的保留时间分别出现在0.89 min和1.24 min，对比图1-A保留时间在0.89 min所示的物质应是多巴。图2-A和图2-B所示分别为多巴胺标准品和样品的色谱图，所示物质的保留时间均在0.98 min，两者应为同一物质即多巴胺。

图1 多巴标准品(A)及样品(B)的色谱图

图2 多巴胺标准品(A)及样品(B)的色谱图

2.2 多巴和多巴胺标准品的标准曲线及线性回归方程

图3所示为以多巴标准品浓度为X轴和相应检测值为Y轴制作的标准曲线，计算得线性回归方程为y=1 337.431 68x+2 085.691 49(r=0.992 63)，在10～200 μg/L范围内线性关系良好。图4所示为以多巴胺标准品浓度为X轴和相应检测值为Y轴制作的标准曲线，计算得线性回归方程为y=1 652.106 72x+9 033.529 10(r=0.999 85)，在10～200 μg/L范围内线性关系良好。

图3 多巴标准曲线

图4 多巴胺标准曲线

2.3 样品内多巴和多巴胺的含量

从图5可以看出：浅580第8天脱水干蚕蛹体内多巴和多巴胺的含量分别为79 955 μg/kg和1 035 μg/kg；580第8天脱水干蚕蛹体内多巴和多巴胺的含量则分别为38 735 μg/kg和3 400 μg/kg。浅580第8天蛹体内的多巴含量是580第8天蛹体内的2倍多，差异极显著；而浅580第8天蛹体内所含的多巴胺含量却不到580第8天蛹体内含量的1/3，差异水平也达到了极显著。浅580与580蛹体内多巴与多巴胺这2种黑色素前体物质含量的显著差异导致的黑色素含量不同是二者表现出不同程度的黑化表型的直接原因。

图5 样品580与浅580第8天蛹体内多巴与多巴胺含量

3 小结与讨论

家蚕暗化型突变早在1961年就有了报道，但直到詹帅和代方银等把BmiAANAT基因确定为暗化突变基因(mln)才解析了其发生的原因，该基因的表达产物为芳烷基乙酰转移酶，其催化底物是多巴胺[6-7]。多巴胺是家蚕黑色素代谢通路的关键物质，是由酪氨酸经酪氨酸羟化酶作用合成多巴再经多巴脱羧酶作用生成的，下游代谢有3条转化途径：一是在酶的作用下与β-丙氨酸结合生成N-β-丙酰多巴胺，最后合成黄褐色的色素；二是经芳烷基乙酰转移酶作用转化为N-乙酰基多巴胺，最终生成无色或透明的色素；三是在一系列酶的催化下生成深棕色的多巴胺黑色素。BmiAANAT基因发生突变，使第2条途径受阻就是暗化型家蚕的发生原因[8-11]。2015年LONG等[12]在家蚕中鉴定出了另1条AANAT基因，将其命名为BmiAANAT2，并通过基因敲除技术证实该基因编码的酶也具有催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能，其表达产物与BmiAANAT编码的酶相似度高达57%。

MATTHEW等[9]通过克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全长序列和测定其相对表达量分析了2个基因与浅暗化型家蚕形成的关系，克隆和测序结果显示，家蚕品系580与浅580所含BmiAANAT的突变类型是相同的，突变后的基因碱基序列与以前的报道一致；580与浅580这2个家蚕品系间BmiAANAT2的碱基序列也无差异。分析荧光定量PCR相对表达量结果时发现，580与浅580这2个家蚕品系间BmiAANAT和BmiAANAT2的相对表达量都存在极显著的差异，且家蚕品系580的2个暗化突变基因的相对表达量均显著上调。综合分析，家蚕品系浅580的发生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2碱基序列突变造成的，而与体内这2个基因的相对表达量显著下降有关；并认为幼虫期、蛹期末期、蛾期等发育阶段浅580品系的个体都表现出比580品系的个体黑化程度更浅的表型特征，是源于体内较低的黑色素含量，结合浅580个体内BmiAANAT、BmiAANAT2的表达量大幅下调，从而推测家蚕品系浅580个体内黑色素的前导物多巴胺含量也应该低于家蚕品系580。

本研究，以暗化型家蚕品系580和浅580的第8天蛹为材料，利用LC-MS/MS分析蛹体内多巴和多巴胺等黑色素前体物质含量变化，结果显示，浅580第8天蚕蛹内多巴的含量是580第8天蚕蛹的2倍多，而浅580第8天蚕蛹内多巴胺的含量明显低于580第8天蚕蛹。这一结果不仅验证了前期的推测，也进一步证明了浅580的浅暗化表型的发生与其体内过低的多巴胺含量直接相关，多巴胺含量的降低通过反馈调节使BmiAANAT、BmiAANAT2的表达量下调的同时也使多巴胺黑色素的生产量下降；但为什么浅580体内高水平含量的多巴不转化为多巴胺，且也没有产生大量的多巴黑色素(为黑褐色)进而使浅580表现出深暗化表型的机理，还需更加深入的研究。