修复条件对矿化垃圾强化微生物修复石油污染土壤的影响

刘庆梅,王亚婷,李静文,陶红群

（成都市环境保护科学研究院，四川 成都 610072）

0 引言

随着石油石化行业的快速发展，因石油开采、运输和储存等生产过程以及泄漏事故造成的土壤石油污染日益严重，不仅造成土壤的废毁，还通过食物链危害人类健康。生物修复相对于物理、化学修复方法更环保、经济、降解彻底，是修复石油污染土壤的主要方法。但生物修复法存在周期长、自然降解效果差、受环境影响大等问题，阻碍了生物修复更好的应用。有研究发现，可通过添加外源菌剂、表面活性剂、人工通风等措施来强化生物修复，但修复成本过高。此外石油生物降解还受到多种物理、化学和生物因素的影响，仅使用一种强化方法难以获得较好的修复效果，但同时采用多种强化方法又会提高生物修复成本[1]。因此，如何进一步提高生物修复效果，降低修复成本，是目前国内外研究的热点之一。

石油污染会导致土壤的碳氮比和碳磷比失去平衡，降低了土壤透气性和渗透性，使土壤肥力降低，抑制了土壤中微生物的活性和生长。而矿化垃圾的孔隙度高，阳离子交换能力较强，富含营养元素和有机质，且含有数量大、种类多的微生物，其中还包含大量的石油降解菌[2-3]。试验表明，添加矿化垃圾能大幅提高石油污染土壤的微生物修复效果。添加矿化垃圾在改善石油污染土壤pH 值、持水性和透气性的同时，还增加了土壤的阳离子交换量、有机物含量、营养元素水平、石油降解菌含量和多样性，兼具生物刺激和生物添加的功能，一定程度上能取代添加膨松剂、pH 值调理剂、肥料、表面活性剂、电子受体和微生物菌剂等措施，大幅降低了生物修复成本[3]。CHEN F 等[4]和CHEN W M 等[5]的研究也进一步验证了矿化垃圾对石油污染土壤微生物修复的强化作用。此外，因矿化垃圾本身就是垃圾，存量大、埋深浅，方便利用。矿化垃圾应用于石油污染土壤修复，可为填埋场腾出可观库容或将填埋土地作为它用[6]。但是目前，修复条件对矿化垃圾强化微生物修复石油污染土壤的影响还不清楚，无法确定最佳修复条件，阻碍了矿化垃圾在石油污染土壤原位修复中的应用。

基于此，通过土壤含水率、温度、矿化垃圾的质量分数以及翻耕频率等单因素对微生物修复石油污染土壤的影响试验，对比不同修复条件下石油污染物的去除率和土壤荧光二乙酸酯(FDA)水解酶活性的差异，分析修复条件对修复效果和土壤微生物总活性的影响，以此确定最佳修复条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用清洁土壤采自四川省江油市东安乡（纬度31°44'N；经度104°44＇E）未受到污染的农田表层土，经自然风干后过孔径为2 mm 的筛网，混匀装袋备用。预处理后的清洁土壤质地为沙壤土，其粘粒、粉粒和砂粒占比分别为66.75%，21.86%和11.39%，pH 值为8.36，渗透系数为2.25 × 10-4cm/s，电导率为118.65 μs/cm。所用石油为中石油川庆钻探工程有限公司钻井井口内废油，主要包含机油、液压油、柴油和润滑油等，其组分的质量分数分别为饱和烃69.41%，芳香烃3.27%，极性组分27.32%。采用石油污染土壤配置方法，将一定质量的废油混入清洁土壤，采用砂石搅拌器混匀，间断翻动风干4 d，去除易挥发的石油组分后待用。试验用矿化垃圾采自封场的宜宾市城市生活垃圾卫生填埋场，剔除垃圾中的塑料、金属、玻璃等杂物，再过孔径为10 mm 的筛网后放入聚乙烯袋中备用。

1.2 试验方法

总石油烃含量(TPH)采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS) 测定；FDA 水解酶活性采用荧光素比色法测定。这2 个指标的详细测定方法参照文献[3]。

1.3 试验步骤

土壤修复试验容器为1 L 的透明塑料桶，直径为11 cm，高为14 cm。修复试验在步入式环境试验箱中进行，修复周期为84 d，每天采用重量法保持固定的土壤含水率。试验设计采用单因素试验方法，在其他修复条件相同的情况下，分别监测不同含水率、温度、矿化垃圾质量分数（干重）和翻耕频率对TPH去除率和土壤FDA 水解酶的影响。每个修复试验中污染土壤的干重为500g，TPH 的质量分数为50mg/g，并设置不添加矿化垃圾的石油污染土壤自然衰减对照试验，每个试验设3 个平行试验。每14 d 通过5点采样法采混合土样用于指标分析。具体试验设计见表1。

表1 矿化垃圾强化微生物修复条件的优化试验设计

2 试验结果

2.1 土壤含水率对修复效果的影响

土壤含水率与石油污染物生物降解之间关系较为复杂，土壤石油污染物生物降解过程中微生物量和活性的高低，以及土壤含氧量和氧气传导都与土壤含水率密切相关。另外，土壤含水率还会影响石油污染物在水相中的溶解量[7]。当土壤含水率分别为10%，15%，20%，30%和40%时，矿化垃圾对土壤中TPH 的去除效果见图1。由图1 可以看出，含水率对土壤中TPH 的去除率影响很大。在土壤含水率为15%时，矿化垃圾对土壤中TPH 的去除效果最好，去除率达到87.98%；含水率低于15%时，TPH 去除率随含水率降低而下降；含水率在15%～30%之间时，TPH 去除率随含水率升高而降低；含水率高于30%时，TPH 去除率随含水率升高而增加。推断原因可能是当含水率低于15%，土壤水分不能满足微生物生长、繁殖和代谢活动的需要，且低含水率使石油污染物难以在固液界面传递，阻碍了石油污染物与微生物接触，因而TPH 降解效果较差；当含水率在15%～30%之间时，土壤含水率的升高减少了土壤空隙，使得土壤含氧量降低且氧气传导速度变慢，阻碍了微生物的生长、繁殖和代谢活动，因而微生物对TPH 的降解效果变差；当含水率高于30%时，接近土壤饱和含水率，土壤以厌氧或缺氧环境为主，TPH降解也以厌氧降解为主导，TPH 降解的电子受体不再是氧气，因而氧气匮乏不再限制TPH 生物降解，微生物导致TPH 去除率变高[8]。在实际的原位土壤修复中，土壤田间持水率一般在30%以下，土壤含水率很难保持在田间持水率以上。

图1 不同土壤含水率条件下TPH 的去除效果

不同土壤含水率条件下修复过程中土壤中FDA 水解酶活性随修复时间的变化见图2。由图2可以看出，在修复前28 d，FDA 水解酶活性快速升高。当土壤含水率为15%时FDA 水解酶活性最高，其次依次是含水率为20%，40%，30%和10%。之后，除含水率10%的修复试验中FDA 水解酶活性继续升高，其它含水率修复试验的FDA 水解酶活性都开始波动下降，含水率10%的修复试验中FDA 水解酶活性在修复第42 天后开始下降；含水率40%的修复试验中FDA 水解酶活性在修复最后14 d 内有所升高。说明在含水率为15%时土壤中总微生物活性最高；含水率低于15%时，微生物活性增长缓慢，增长时间较长。不同微生物对土壤含水率有不同的适应性，真菌适于在干燥的条件下生长，而细菌在较高的湿度条件下也可以较好的生长[7]。

图2 不同土壤含水率条件下修复过程中土壤FDA 水解酶活性的动态变化

2.2 温度对修复效果的影响

温度影响土壤石油污染物降解效率的主要方式有2 种：①温度直接影响石油降解菌的生长繁殖和微生物群落结构；②温度影响石油污染物的物理状态和化学特性，间接影响石油污染物生物降解。在环境温度分别为5，15，25 和35 ℃条件下矿化垃圾对土壤中TPH 的去除效果，见图3。由图3 可以看出，环境温度对TPH 降解影响较大。当温度为25 ℃时，矿化垃圾对TPH 的去除效果最好，去除率为76.93%。ZAPPI M E 等[9]发现好氧修复石油污染土壤的最佳温度在15～30 ℃之间。当温度低于25 ℃时，TPH 去除率随温度降低而下降；当温度高于25 ℃时，TPH 去除率随温度升高而降低。推断原因可能是温度低于25 ℃时，导致土壤微生物生长和繁殖的速度变慢，与TPH 降解有关的酶活性也降低；同时温度下降也会降低石油污染物在水中的溶解度，石油污染物的生物可利用性也降低，因而TPH 的降解效果较差；当温度高于25 ℃时，会增加石油污染物的挥发性，石油污染物的微生物毒性增加，因而TPH的降解效果变差；当温度为5 ℃时，矿化垃圾对TPH也有少量的去除。因为尽管低温下微生物的活性很弱，一些嗜冷菌仍会降解石油烃[10]；当温度为35 ℃时，高温使得土壤水分蒸发量变大，每次浇水前测得该组试验的土壤含水率都低于其它试验组，这可能影响TPH 降解。在实际土壤修复中，频繁的浇水也会增加修复成本。

图3 不同温度条件下TPH 的去除效果

不同温度条件下修复过程中土壤FDA 水解酶活性的动态变化，见图4。由图4 可以看出，当温度为25 ℃时FDA 水解酶活性最高。修复前14 d，温度为35℃的修复试验条件下的FDA 水解酶活性比25℃时高。修复14 d 后，温度为35 ℃修复试验条件下的FDA 水解酶活性比25 ℃时低。整个修复过程中，温度为5 ℃修复试验条件下的FDA 水解酶活性一直明显低于其它3 组。这说明温度为25 ℃时土壤中总微生物活性最高，温度高于或低于25 ℃时土壤中总微生物的活性都有所降低。不同温度条件下土壤中优势菌群的种类和结构也不同，这也会影响土壤中TPH 的降解效果[11]。

图4 不同温度条件下修复过程中土壤FDA 水解酶活性的动态变化

2.3 矿化垃圾的质量分数对修复效果的影响

因矿化垃圾的孔隙度较高，富含营养元素和有机质，石油降解菌的数量和活性也很高，添加矿化垃圾相当于向被石油污染的土壤中加入了膨松剂、肥料、有机质和微生物菌剂等，有利于被石油污染的土壤的微生物修复。添加矿化垃圾还能够稀释石油污染物的浓度，降低其对微生物的毒性。但是矿化垃圾中的盐分含量也很高[12]，过高的盐分会抑制土壤微生物的生长，石油污染物的降解效率也会下降[13-15]。而且矿化垃圾添加量越多，相应的运输成本也会增加。因此，试验考察了矿化垃圾的质量分数分别为10%，25%，50%和75%条件下土壤中TPH 的去除效果，见图5。由图5 可以看出，当矿化垃圾的质量分数小于50%时，TPH 的去除率随质量分数的升高而增大。但是当矿化垃圾的质量分数大于50%时，TPH 的去除率反而没有进一步提高。推断原因为当矿化垃圾的质量分数为50%时，土壤孔隙度、营养元素和有机质含量等条件已能够满足微生物生长繁殖和降解石油污染物的需要，不再是TPH 生物降解的限制因素。继续增加矿化垃圾的质量分数，虽增加了微生物量，但含量过高的土壤盐分开始抑制微生物的降解活性，所以TPH 去除率并没有提高。添加矿化垃圾会稀释土壤中石油污染物的浓度，因此随着矿化垃圾的质量分数的提高，修复前TPH 的初始浓度有所降低。在相同TPH 去除率的情况下，当矿化垃圾的质量分数为75%时，修复后土壤残余TPH浓度最小。考虑到运输成本，确定矿化垃圾的最优质量分数为50%。

图5 不同矿化垃圾质量分数条件下TPH 的去除效果

不同矿化垃圾质量分数条件下修复过程中土壤FDA 水解酶活性的动态变化，见图6。由图6 可以看出，由于矿化垃圾的FDA 水解酶活性较高[3]，土壤中FDA 水解酶初始活性随着矿化垃圾添加量的增加而增加。修复前期，4 组修复试验中FDA 水解酶活性都快速增加，其中当矿化垃圾的质量分数为75%时FDA 水解酶活性最高，并在修复第14 天达到最大值，而其它3 组修复试验中FDA 水解酶活性在第28 天时就达到最大值。FDA 水解酶活性的最大值也随矿化垃圾添加量的增加而变大，推断原因是当矿化垃圾的质量分数为75%时土壤中初始微生物数量最多，对易降解石油污染物的降解最快，修复中期FDA 水解酶活性快速下降后又缓慢增加，此阶段当矿化垃圾的质量分数为75%时FDA 水解酶活性下降最多，低于矿化垃圾质量分数为50%修复试验。这是因为矿化垃圾质量分数为75%的修复试验中TPH 的降解进程更快，易降解石油污染物被快速消耗后，土壤可利用的碳源变少，种类也急剧变化，微生物的种类和活性也随之变化，导致FDA 水解酶活性降低。但在修复结束后，矿化垃圾质量分数越大的修复试验中FDA 水解酶活性也越高，推断原因是矿化垃圾质量分数越大的修复试验中土壤有机质含量更高。

图6 不同矿化垃圾质量分数条件下土壤中FDA 水解酶活性的动态变化

2.4 翻耕频率对修复效果的影响

翻耕在石油污染土壤生物修复过程中的目的是保证土壤中氧气、水分和微生物空间分布的均匀性，将空气中的氧气扩散进土壤，同时把土壤中石油污染物降解产生的二氧化碳置换出来，保证石油污染物生物降解在充分的好氧条件下进行[7]。试验考察了不翻耕和翻耕频率分别为1 d 1 次，2 d 1 次，4 d 1次和6 d 1 次条件下土壤中TPH 的去除效果，见图7。由图7 可以看出，翻耕频率对土壤中TPH 去除率的影响很小。不翻耕试验中土壤的TPH 最终去除率最小，为86.71%；而翻耕1 d 1 次试验中土壤的TPH最终去除率为89.05%，相差很小且在TPH 监测的误差范围内。推断原因是添加矿化垃圾后导致土壤孔隙度较大，无需通过翻耕来增加氧气供应和二氧化碳扩散。另外，由于本试验规模较小，在实际土壤修复中，石油污染物往往仅存在于土壤表层（0～30 cm）[16]，经常翻耕反而会增加石油污染物向土壤深层扩散的风险。同时考虑到翻耕会增加修复成本，在添加矿化垃圾强化石油污染土壤微生物修复时无需采取翻耕措施。

图7 不同翻耕频率条件下TPH 的去除效果

不同翻耕频率条件下土壤中FDA 水解酶活性的动态变化，见图8。由图8 可以看出，增加翻耕频率对土壤FDA 水解酶活性仅有小幅提高。在整个修复过程中土壤FDA 水解酶的变化趋势也相似。这说明增加翻耕频率对土壤的总微生物活性影响也很小。

图8 不同翻耕频率条件下土壤中FDA 水解酶活性的动态变化

3 结论

通过土壤含水率、温度、矿化垃圾的质量分数以及翻耕频率等单因素对微生物修复石油污染土壤的影响试验，对比不同修复条件下石油污染物的去除率和土壤FDA 水解酶活性的差异。发现土壤含水率、环境温度和矿化垃圾质量分数对矿化垃圾强化微生物修复石油污染土壤的效果影响较大，而翻耕频率的影响很小，因此修复过程中无需采取翻耕措施。

（1）当土壤含水率为15%时，矿化垃圾对TPH的降解效果最好；当含水率低于15%时，TPH 的降解效果随含水率降低而下降；当含水率在15% ～30%之间时，TPH 降解效果随含水率升高反而降低；当含水率高于30%时，随着含水率继续增加导致TPH 去除逐渐以厌氧降解为主导，TPH 的降解效果也有所增加。

（2）当环境温度为25 ℃时，矿化垃圾对TPH 的降解效果最好；当温度低于25 ℃时，TPH 降解效果随温度降低而下降；当温度高于25 ℃时，TPH 降解效果随环境温度升高反而下降。

（3）当矿化垃圾质量分数小于50%时，TPH 降解效果随矿化垃圾质量分数升高而增加；当矿化垃圾质量分数大于50%时，再增加矿化垃圾的质量分数也没有进一步提高修复效果。因此确定矿化垃圾的最优质量分数为50%。