泊洛沙姆作为温度敏感型凝胶基质的安全性评价

徐雨生，廖川江，段美娟＊

（1. 湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2. 大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000）

温度敏感型原位凝胶（thermosensitive in situ gel）是目前研究较为广泛的敏感型原位凝胶之一[1-3]。其优点在于以原位凝胶为载体携带药物可直接患部给药，提高药物生物利用度，组织亲和力强，给药后可亲和给药部位，并迅速发生相变形成半固体凝胶，高度亲水性的三维网格结构可将药物束缚其中，延长药物在用药部位的滞留时间，具有良好的缓释作用[4-5]；组织相容性好，对机体刺激性很小，使用方便有效[6]；适用范围广，局部作用药物、全身作用药物、大分子药物、亲水性药物和疏水性药物等多数药物均可以原位凝胶为载体[7]。

泊洛沙姆（poloxamer）作为一类食品添加剂和药物制剂的辅料（赋形剂）在化工、生物工程、医药等领域有着广泛应用[8]。泊洛沙姆是一种高分子非离子型表面活性剂，其毒性低，生物相容性好，且具有低温时为流动液体，体温下成凝胶状的特性，是理想的药物控释材料[2]。目前国内尚未见有关其毒性研究的报道。本研究对泊洛沙姆作为妇科疾病局部给药的温度敏感型凝胶基质的安全性进行了初步评价，为临床应用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

EL-104型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；MilliQ Plus超级纯水仪（广州艾科普公司）；ASP-300S型自动脱水机（德国Leica公司）；BM-VIII型生物组织包埋机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；RM2245型手动切片机（德国Leisa公司）；YT-7FB型生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；BI-2000型医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 试剂

泊洛沙姆P 4 0 7（批号：W P E H 5 4 0 B，BASF）；泊洛沙姆P188（批号：WPYH570B ，BASF）；生理盐水（批号：15102404，昆明市宇斯药业有限责任公司）。

1.3 实验动物

健康SPF级昆明种小鼠222只，雌雄各半，体重18～22 g；健康SPF级SD大鼠34只，雌性未孕，体重220～260 g，均由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证：SCXK（湘）2014-0011，饲养于大理大学实验动物中心的 IVC 系统。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 泊洛沙姆P407溶液制备 称取适量泊洛沙姆P407固体，加入三蒸水，配制成浓度为30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %（w/w）的泊洛沙姆P407溶液。

2.1.2 泊洛沙姆P188溶液制备 称取适量泊洛沙姆P188固体，加入三蒸水，配制成浓度为40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %（w/w）的泊洛沙姆P188溶液。

2.1.3 泊洛沙姆P407/P188混合溶液制备 按质量比2.5:1，称取适量泊洛沙姆P407、P188固体，加入三蒸水，配制成浓度为40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %（w/w）的泊洛沙姆P407/P188混合溶液。以40.00 %的泊洛沙姆P407/P188混合溶液作为空白凝胶。

2.2 经口急性毒性试验

2.2.1 半数致死剂量（LD50）的测定 选取昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，每组10只，分别按20 ml/kg剂量灌胃给予生理盐水、30.00 %泊洛沙姆P407溶液、40 %泊洛沙姆P188溶液、40 %泊洛沙姆P407/P188混合溶液[9]。试验小鼠于给药前12 h和给药后4 h内禁食，饮水自由，给药后逐日观察，连续14 d，参照《药物毒理学实验方法与技术》[10]，观察小鼠用药后有无中毒表现、出现时间、持续时间和恢复时间，死亡时间，并记录小鼠外观、行为、排泄物、死亡数和死亡情况。隔天记录小鼠的体重。

2.2.2 经口最大耐受量（MTD）的测定 选取昆明种小鼠32只，随机分成2组，每组16只，雄雌各半，第一组按最大可给药体积（40 ml/kg）[9]灌胃给予空白凝胶，第二组给予等容积的生理盐水。试验小鼠于给药前12 h和末次给药后4 h内禁食，饮水自由，试验当天首次给药后间隔6 h再次给药，逐日观察，连续14 d，参照《药物毒理学实验方法与技术》[10]，观察小鼠用药后有无中毒表现、出现时间、持续时间及恢复时间，死亡时间，并记录小鼠行为、排泄物，死亡数和死亡情况。隔天记录小鼠的体重。

2.3 腹腔注射急性毒性试验

选取昆明种小鼠150只，雄雌各半，随机分为15组，每组10只，分别按20 ml/kg剂量，腹腔注射[9,11]方式给予泊洛沙姆P407溶液（浓度分别为30.00 %，24.00 %，19.20 %，15.36 %，12.29 %）、泊洛沙姆P188溶液（浓度分别为40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %）、泊洛沙姆P407/P188混合溶液（浓度分别为40.00 %，32.00 %，25.60 %，20.48 %，16.38 %，13.10 %）。试验小鼠给药前12 h和末次给药后4 h内禁食，饮水自由，给药后逐日观察，连续14 d，参照《药物毒理学实验方法与技术》[10]，观察小鼠用药后有无中毒表现、出现时间、持续时间及恢复时间，死亡时间，并记录小鼠外观、行为、排泄物、死亡数和死亡情况。隔天记录小鼠的体重、饮水量和采食量。

2.4 阴道给药急性毒性试验

选取雌性未孕大鼠18只，按体重随机分为3组，每组6只。按0.01 ml/10 g剂量阴道给药，第一组12 h内给予空白凝胶4次，第二组12 h内给予空白凝胶6次[11]，第三组为空白对照组，不给药。试验大鼠给药前12 h和末次给药后4 h内禁食，饮水自由，给药后参照《药物毒理学实验方法与技术》[10]，逐日观察，连续7 d，并记录中毒反应、死亡数和死亡情况，隔天记录大鼠的体重。

2.5 阴道黏膜刺激性试验

选取雌性未孕大鼠16只，按体重随机分成两组，分别为空白凝胶组和空白对照组，每组8只。空白对照组不给药，空白凝胶组按0.01 ml/10 g剂量大鼠阴道给药[1,3]，连续14 d，给药期间观察大鼠中毒情况及阴道局部的变化，记录中毒反应、阴道病变情况、大鼠死亡数和死亡情况。隔天记录大鼠的体重，并于给药后第8天和第15天，各组分别随机处死2只大鼠，取出阴道组织，10 %福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，进行病理组织学检查[12-13]。试验期间若有死亡大鼠应及时解剖，观察其脏器组织形态、颜色有无异常，有明显病变者需取材进行病理组织学检查。根据《中药药理研究方法学》“中药阴道制剂毒性试验方法”对阴道黏膜刺激反应的评定要求分别对肉眼和病理组织学观察进行评分[14]。

3 数据处理与统计分析

4 结果

4.1 小鼠经口急性毒性试验结果

小鼠灌胃给予泊洛沙姆P407溶液的LD50>6.00 g/kg；小鼠灌胃给予泊洛沙姆P188溶液的LD50>8.00 g/kg；小鼠灌胃给予泊洛沙姆P407/P188混合溶液的LD50>8.00 g/kg；各组小鼠在给药后立即出现竖毛、蜷缩、扎堆的现象，1 h后基本恢复正常，4 h后陆续出现稀便的现象，24 h后基本恢复正常。14 d的观察期内均未出现严重的不良反应或死亡，体重随试验时间的延长而增加。观察期内，每只小鼠投食量为4 g/d，所有受试小鼠都能吃完当天的饲料。14 d后处死部分小鼠，解剖无可见脏器的病变。

小鼠灌胃给予空白凝胶的MTD>16 g/kg。NS对照组小鼠在给药后14 d的观察期内均未出现明显的异常、不良反应或死亡，体重也随实验时间的延长而增加。空白凝胶组小鼠在首次给药后 4 h 陆续出现稀便的现象，第二次给药后4 h小鼠的大便呈黏稠的液体状，末次给药结束后24 h小鼠逐渐恢复稀便，48 h后小鼠大便恢复正常。空白凝胶组小鼠于首次给药后立即出现竖毛、蜷缩、扎堆的现象，1 h后恢复活跃状态；第二次给药后大部分小鼠有干呕的现象，小鼠有竖毛、安静、扎堆的表现，4 h后投食，所有小鼠进食表现基本恢复正常。

4.2 小鼠腹腔注射急性毒性试验结果

结果显示，小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407溶液的LD50为3.66 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P188溶液的LD50为7.74 g/kg；小鼠腹腔注射泊洛沙姆P407/P188溶液的LD50为5.62 g/kg；小鼠腹腔注射不同基质后在14 d的观察期内出现不同程度的毒性反应：泊洛沙姆P407组：药物注射后小鼠活动、状态正常，20 min后部分小鼠活动缓慢、状态变差、竖毛、喜扎堆、饮食量正常，24 h后开始有小鼠死亡，最高剂量组死亡小鼠眼睛流泪，解剖发现腹腔内有积液，肉眼观察肝脏色泽暗淡，肠系膜血管充盈，其余剂量组死亡小鼠解剖发现肝脏色泽暗淡，其余组织和脏器无异常；泊洛沙姆P188组：药物注射后小鼠活动、状态正常，20 min后部分小鼠活动缓慢、状态变差、竖毛、喜扎堆、饮食量正常，24 h后部分小鼠逐渐恢复，48 h后最高剂量组开始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖发现肝脏色泽暗淡，其余组织、脏器无异常；泊洛沙姆P407/P188组：药物注射后小鼠活动、状态正常，20 min后部分小鼠活动缓慢、状态变差、竖毛、喜扎堆、饮食量正常，72 h后最高剂量组开始有小鼠死亡，死亡小鼠解剖发现肝脏色泽暗淡，其余组织、脏器无异常，结果见表1。

表1 小鼠腹腔注射泊洛沙姆的急性毒性试验LD50测定结果（n=10）

结果表明，泊洛沙姆以腹腔注射方式给药会有一定的毒性。该产品主要为外用，该结果可为其他用药途径毒性评价提供一定的参考。

4.3 大鼠阴道给药急性毒性试验结果

空白凝胶12 h内分别4次或6次给药，在给药后7 d的观察期内，所有大鼠进食正常，均未出现任何不良反应和死亡，体重也随着试验的延长而增加。根据试验结果，空白凝胶组大鼠阴道给药的MTD>2.40 g/kg。

4.4 大鼠阴道黏膜刺激性试验结果

所有大鼠在14 d的给药期内进食正常，未出现任何不良反应和死亡，体重也随试验的延长而增加，给药期间大鼠阴道外周未见明显的红斑、水肿和脓性分泌物；连续给药14 d内，空白凝胶对大鼠的阴道黏膜无明显的刺激性；空白凝胶给药7 d和14 d的大鼠阴道组织，在40倍显微镜下可见组织结构正常，层次分明，少量淋巴细胞和中性粒细胞分散浸润，与正常大鼠相比黏膜层及黏膜下层未见明显变化，结果见表2、3及图1。

图1 各组大鼠阴道组织病理切片（HE，×40）

表2 阴道黏膜刺激性试验大鼠外阴肉眼评分（n=8）

表3 阴道黏膜刺激性试验大鼠阴道病理组织学评分（n=2）

5 结论

此产品拟专为治疗妇科疾病研制，故局部毒性和刺激性实验结果更具有实际意义。由泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P188组成的温敏型空白凝胶基质经小鼠口服、阴道黏膜给药基本无毒。泊洛沙姆可作为对人体基本无毒性、无局部刺激性的治疗妇科疾病局部给药的温敏型凝胶基质。