抗cH5/3抗体Luminex检测系统的构建及其在HA杆部抗体应答研究中的初步应用

何 江，苏 敏，刘福慧，张 柯，陈 瑶，龙兆钇，袁栋波，董俊杰，何张祎檬，黄俊琼

(1.遵义医科大学附属医院 输血科，贵州 遵义 563099；2.遂宁市中心医院 输血科，四川 遂宁 629200；3.遵义医科大学临床医学系，贵州 遵义 563099；4.长沙医学院中医学院，湖南 长沙 410219)

不同亚型流感病毒尤其同一进化组内血凝素(Hemaglutinin,HA)杆部相对保守，针对HA杆部的抗体可与不同亚型流感病毒发生交叉结合。然而，通常情况下针对血凝素的抗体应答以HA头部为优势，流感病毒感染或疫苗接种后血清杆部抗体水平很低，难以用常规方法检测。Luminex是在有色微球、激光技术、应用流体学及高速数字信号处理技术的基础上发展起来的一种多功能液相分析平台，检测灵敏度高，可同时快速测定多达50种流感毒株的抗流感病毒HA抗体浓度。本研究利用昆虫杆状病毒系统表达嵌合血凝素蛋白cH5/3，它由流感病毒H5头部和病毒H3杆部组成，正常人群体内不存在抗H5流感病毒抗体，因此cH5/3只能检测到针对H3杆部的抗体，将纯化的cH5/3蛋白与有色微球偶联后构建Luminex检测体系，用于流感病毒诱导HA杆部抗体的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 四价流感病毒裂解疫苗购自华兰生物公司；Bio-Plex® Amine Coupling Kit和Bio-Plex Pro Magnetic COOH Beads购自Bio-Rad公司；BSA和蛋白偶联试剂盒购自Sigma公司；His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb(CST)、Goat anti-rabbit IgG-PE和Goat anti-human IgG-PE购自SouthernBiotech公司；Sf9细胞系购自上海研一公司；灭活H7N9禽流感病毒由中国科学院微生物研究所毕钰海教授惠赠。

1.2 对象 本研究共招募12名健康志愿者，年龄19～32岁，平均23岁。所有受试者均为健康成人，未接种过流感疫苗，无自身免疫性疾病，未使用激素或免疫抑制剂。该项目获得遵义医科大学医学伦理会批准，并与所有志愿者签署书面知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 重组杆状病毒BV-cH5/3的构建 参阅Genebank上的A/Perth/16/2009(H3N2，GQ293081.1)和A/VietNam/1203/04(H5N1，HM006759.1)HA基因序列，取H5头部和H3杆部序列合成嵌合HA基因(cH5/3)。去掉信号肽与跨膜区，在N端引入Gp67信号肽序列，C端引入凝血酶序列、折叠序列和6×His标签(见图1)。将cH5/3基因插入pFastBac1构建重组质粒，重组质粒转化至含有杆状病毒基因组转座子(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac。重组质粒Bacmid-cH5/3用BamhI和HindⅢ进行双酶切鉴定。通过M13引物(正向：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′，反向：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)对重组质粒进行PCR鉴定。将鉴定正确的重组质粒转染至sf9细胞，(28±2)°C培养72 h后收集上清液，即为重组杆状病毒BV-cH5/3。以重组杆状病毒核酸为模板，PCR扩增cH5/3基因，送上海生物工程有限公司进行测序。

图1 cH5/3基因构建情况

1.3.2 目的蛋白的表达及纯化 将重组杆状病毒(MOI=1)感染sf9细胞。感染72 h后离心收集上清液，用Ni柱进行蛋白纯化。收集洗脱液，测定OD280值。将洗脱液经10kD的超滤管浓缩到1 mL，分装，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量试剂盒检测复性蛋白的浓度，并用Western blot进行特异性鉴定。

1.3.3 抗cH5/3抗体Luminex检测系统的构建 取50 μL微球(6.25×105)至偶联管中，加100 μL洗液，于磁性分离器上静置2 min分离磁珠。用80 μL活化缓冲液重悬微球，加入10 μL S-NHS和10 μL EDC室温避光反应20 min。加入2 μg cH5/3蛋白室温避光反应2 h，血球计数板计数微球，并进行磁珠的偶联验证。取96孔板，设置6个阳性测试孔(His-Tag Rabbit mAb，1 000～0.975 ng/mL)和1个阴性对照孔(Rabbit mAb，1 000 ng/mL)。每孔加入5 000个偶联微球和50 μL抗体，室温震荡孵育2 h后加入50 μL二抗，继续孵育30 min。Luminex 200分析微球的荧光信号值。

1.3.4 疫苗接种与样本收集 所有志愿者根据标准免疫程序接种四价流感疫苗。在疫苗接种前和接种后第28天采集外周血10mL，分离血浆，-80 ℃保持。

1.3.5 B细胞的体外刺激与培养 采集志愿者外周血50 mL，淋巴细胞分离液分离PBMC，用磁珠分离试剂盒分离B细胞，得到约5×105个目的细胞，加入IL-2(50 ng/mL)、CpG2006ODN(6 μg/mL)和灭活H7N9流感病毒(10 μg/mL)，37 ℃培养6 d，收集细胞培养上清液。

1.3.6 Luminex系统检测抗H3杆部抗体 于96孔板中加入25 μL cH5/3蛋白包被的彩色微球，再加入25 μL血清(1∶5 000)或上清液，置于旋转摇床上室温800 rmp孵育2 h，用150 μL洗涤缓冲液洗涤3次，加入PE标记的羊抗人IgG，继续孵育2 h，Luminex200分析荧光强度。

1.3.7 间接ELISA法测定血清中的抗H3杆部抗体 将2 μg cH5/3蛋白包被在96孔ELISA板上，4 ℃过夜，0.5%的PBST洗涤5次后，1%BSA，37 ℃封闭2 h，PBST洗涤5次，加入稀释后的血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育1 h，加入显色剂避光显色15 min，酶标仪上450 nm进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒Bacmid-cH5/3鉴定结果 重组质粒经BamhI和HindⅢ双酶切，电泳可见4 700 bp左右和1 700 bp两个条带，目的基因条带大小与预期相符(见图2A)。提取P2代杆状病毒Bacmind-cH5/3DNA，以cH5/3基因的特异性引物进行PCR扩增，得到一条约为1 700 bp的条带，与预期一致(见图2B)。重组杆状病毒BV-cH5/3经测序验证目的基因序列完全正确。

A：双酶切鉴定(MW:Marker 10 000; 1:空载体; 2:重组载体)；B：PCR鉴定(MW:Marker 7 000; 1-5:Bacmind-cH5/3质粒PCR产物)。图2 重组质粒Bacmid-cH5/3鉴定结果

2.2 纯化蛋白的鉴定 目的蛋白经Ni柱纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果均于67.5kD位置显示唯一条带(见图3)，与预期结果相符，表明目的蛋白表达正确，蛋白的纯度及特异性好。

A：SDS-PAGE; B.Western-blot。图3 纯化cH5/3蛋白的鉴定

2.3 包被蛋白浓度和一抗浓度的确定 分别用2、4、6 μg重组cH5/3蛋白包被相同数量的磁珠，固定二抗浓度(1 000 ng/mL)，将一抗浓度作倍比稀释。结果显示(见表1)，当蛋白浓度为2 μg时，MFI值最大，由此确定最佳蛋白包被浓度为2 μg。当cH5/3蛋白量保持不变时，一抗浓度为1 000 ng/mL时MFI值最大。

表1 CH5/3蛋白包被浓度和一抗浓度确认

2.4 二抗浓度确认 当cH5/3蛋白包被浓度为2 μg时，选取1 000 ng/mL和2 000 ng/mL两个二抗浓度做对比。结果显示，随着二抗浓度提高，MFI值略有提升，但考虑到二抗浓度增加，非特异性信号值也大大提高，最终采用二抗浓度为1 000 ng/mL。

表2 Luminex 二抗浓度确认

2.5 蛋白偶联验证 选择anti-6×His抗体作为阳性对照，与6×His无关的兔源单克隆抗体为阴性对照。将阳性对照作4倍稀释(1 000～0.975 ng/mL)，阴性对照浓度为1 000 ng/mL，二抗浓度为1 000 ng/mL。随着一抗浓度梯度稀释，MFI信号值梯度下降，标准曲线拟合好(R2=0.999 9)，阴性对照信号值很低，证明蛋白与磁珠偶联成功，结果见图4。

图4 CH5/3磁珠偶联验证

2.6 Luminex分析血清中抗H3杆部抗体水平 H5亚型流感病毒在人群中的流行率极低。cH5/3蛋白由H5的头部和H3的杆部构成，当Luminex检测系统检测到与cH5/3蛋白结合的抗体，可初步认为即是抗H3杆部抗体。我们采用建立的抗cH5/3抗体Luminex检测系统检测了13名健康青年志愿者接种疫苗后血清(1∶1 000)中的抗H3杆部抗体，检测信号用平均荧光值(MFI)表示(见图5)，大于阴性对照—Capase-3 Rabbit mAb检测值(MFI=117.5)测视为检测阳性，结果表明13名志愿者血清中均能检测都抗H3杆部抗体。

图5 外周血抗H3杆部抗体水平

2.7 间接ELISA法测定血清中的抗H3杆部抗体 为了比较抗cH5/3抗体Luminex检测系统和间接ELISA法的敏感性，我们利用间接ELISA法检测13名青年志愿者血清中的抗H3杆部抗体。同样采用2μg/mL cH5/3蛋白包被96孔板，将血清稀释度为1∶1 000的OD值与阴性对照—Capase-3 Rabbit mAb(OD450nm=0.242)相比，结果表明间接ELISA法仅检测到2名青年志愿者血清中的抗H3杆部抗体(见图6)。

图6 间接ELISA法测定血清中的抗H3杆部抗体

2.8 Luminex与间接ELISA法结果比较 采用Luminex和间接ELISA法测量13名青年志愿者血清中的抗H3杆部抗体。在血清稀释比例为1∶1 000的条件下，ELISA法检测为阳性的血清有2份，Luminex检测结果均为阳性。

表3 Luminex与间接ELISA法检测血清抗H3杆部抗体结果比较

2.9 Luminex法分析细胞培养上清液中的抗H3杆部抗体水平 外周血B细胞经灭活H7N9病毒刺激6 d后，收集上清液采用Luminex系统分析抗H3杆部抗体水平。结果显示，疫苗接种后B细胞培养上清中抗cH5/3抗体水平较疫苗接种前的B细胞增高4.24(0.8，26.8)倍，差异具有统计学意义(见图7)。

图7 细胞培养上清中抗H3杆部抗体水平

3 讨论

HA是流感病毒表面一种重要的糖蛋白，同时也是病毒中和抗体的主要靶标。HA分为头部和杆部，头部抗原位点很容易发生变异，是流感病毒产生抗原性变异的主要原因[1-2]。头部抗原性的变异常常导致疫苗的有效性大大降低[3]。HA杆部相对来说比较保守，同一进化组内HA杆部抗原性相似。研究证实杆部抗原可以诱导产生交叉反应性抗体[5-6]。然而通常情况下，针对流感病毒HA的抗体应答以头部为优势，在头部抗原不存在的情况下，杆部记忆B细胞可以被激活产生交叉反应性抗体[4]。研究报道，流感病毒HA杆部记忆B细胞仅以极低的频率存在，提示其可能发挥的免疫保护作用非常有限[7-8]。抗流感病毒抗体常规检测方法包括凝集试验、微量中和试验、酶联免疫吸附法等，Moody等报道接种季节性流感疫苗后仅有ELISA法检测到低水平(1∶200稀释)的杆部抗体[9]，检测灵敏度低。为了研究H7N9病毒对HA杆部抗体的诱导作用，本研究建立高敏感性Luminex检测体系用于抗H3杆部抗体的检测。

Luminex又称多功能液相芯片分析系统，是在有色微球、激光技术、应用流体学及高速数字信号处理技术的基础上发展起来的一种多功能液相分析平台[10-11]。根据微球内部三种荧光的不同比例可区分500种不同颜色的微球，通过微球共价交联抗原，与被测定的抗体结合以后，加入荧光素标记的二抗，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量荧光抗体的荧光信号来确定被测分子的浓度。在一次检测中可完成对多个目标分子的分析，大大减少样本的消耗量，节约时间和成本。HA杆部抗原多为构象性表位，其抗原性取决于完整的HA空间构型。本研究根据A/VietNam/1203/04H5N1病毒HA头部和A/Perth/16/2009H3N2病毒HA杆部序列设计cH5/3基因，构建重组杆状病毒BV-cH5/3，并在昆虫细胞中表达，纯化后的cH5/3蛋白偶联磁珠建立抗cH5/3抗体Luminex检测系统。蛋白偶联验证试验结果证明抗cH5/3抗体Luminex检测系统成功建立。由于H5亚型禽流感病毒较少感染人类，人群中抗H5抗体阳性率极低，因此可以初步认为检测到的抗cH5/3抗体是针对H3杆部的抗体。

本研究中，我们采用Luminex检测系统和酶联免疫吸附实验(ELISA)对所有志愿者接种流感疫苗后的血浆进行了抗H3杆部抗体检测，Luminex结果显示13名志愿者血清中均存在抗H3杆部抗体，但ELISA仅能检测到2名志愿者体内的抗H3杆部抗体，表明Luminex检测灵敏度显著高于ELISA法。H3杆部记忆B细胞以极低的频率存在于外周血中。为了探讨流感疫苗接种对HA杆部记忆B细胞二次抗体应答的影响，本研究采用灭活H7N9病毒体外外周血记忆B细胞，细胞培养上清经抗cH5/3抗体Luminex检测系统分析发现，无论是疫苗接种前还是疫苗接种后，H7N9在体外均可刺激记忆B细胞产生抗H3杆部抗体。H7N9和H3N2头部抗原差异大，杆部抗原相似，在缺乏H3头部抗原的情况下，H7杆部能靶向激活H3杆部记忆B细胞增殖分化为浆细胞，产生抗H3杆部抗体。疫苗接种后细胞培养上清中H3杆部抗体水平增高，表明虽然通常情况下记忆B细胞抗体应答以HA头部为优势，但疫苗接种后杆部记忆B细胞频率仍有增高，表明流感疫苗可刺激HA杆部记忆B细胞扩增。

本研究成功建立抗H3杆部抗体Luminex检测系统，检测灵敏度高，可用于血清及细胞培养上清中低水平H3杆部抗体的检测，为进一步研究HA杆部记忆B细胞抗体应答奠定了基础。采用本建立的Luminex检测体系证实与H3N2病毒属于同一进化组的H7N9病毒在体外可刺激H3杆部记忆B产生杆部抗体，且疫苗接种后的B细胞培养上清中H3杆部抗体水平增高，提示疫苗接种后HA杆部记忆B细胞频率增加。但本研究例数，需进一步扩大样本进行验证。