家蚕耐氟性抗血液型脓病品系选育研究

黄　凌

家蚕耐氟性抗血液型脓病品系选育研究

黄凌

（广西壮族自治区蚕业科学研究院广西南宁530007）

将家蚕抗血液型脓病品种的抗性亲本与耐氟化物品种的抗性亲本进行杂交，从后代中筛选出兼耐血液型脓病和氟化物的家蚕个体，用系统选育的方法进行家蚕抗病性品种选育。经测试，新品系2龄起蚕经口添食家蚕核型多角体病毒（BmNPV，以下简写为NPV），半数致死浓度（LC50）为2.18×108个/mL，并且耐受一定浓度的含氟桑叶。在正常环境条件下，该品系的虫蛹率与对照932不相上下，但在环境受NPV污染的情况下，该品系的虫蛹率明显高于对照932。因此，经本研究表明，品系96·NC99R对血液型脓病和氟化物兼具一定耐受性，表现出较强的抗逆性。

家蚕抗病材料；血液型脓病；氟化物

家蚕核型多角体病毒（BmNPV，以下简称为NPV）经食下感染或伤口感染后，通常使家蚕于下一龄期发病或蛹期发病，100%致死，死蚕尸体污染蚕座致使其他蚕儿感染发病，严重可使整批蚕感染病毒致死。桑叶受工厂氟化物污染后出现氟化物中毒，蚕儿食下氟化物中毒的桑叶后出现氟化物中毒症状，环节凸起，发育开叉大，吐丝量减少，严重的可能不结茧，产不出受精卵等。不管是NPV感染或是氟中毒，蚕儿一旦发病或中毒，尚无有效的治疗或解毒方法，现阶段只有消毒防控和培育抗逆性家蚕品种这两种有效方式。有研究结果表明，家蚕耐氟性状呈部分显性遗传，有加性效应，由一对耐氟主效基因和若干微基因控制，该耐氟基因与第12连锁群紧密连锁，F1代耐氟性与杂种优势呈显著正相关，与父本为显著负相关，并且可以较容易地通过表型选拔获得耐氟性个体[1-5]。与耐氟性相似，家蚕对NPV的抗性同样受若干微基因和一对主效基因控制，该抗性基因为显性基因，杂交后代（F1代和F2代）对NPV的抗性呈偏父遗传现象，杂交一代（F1代）的抗NPV性表现出杂交优势，累代添食NPV可提高家蚕品种对NPV的抗性，且经济性状稳定[6-7]。至今已培育出的抗NPV家蚕品种或耐氟家蚕品种有桂蚕N2、华康3号、秋丰×白玉和桂蚕F95等[8-11]，然而，这些品种均只是单一的抗血液型脓病或耐氟化物，尚未报道有家蚕品种兼抗两者。因此，本研究拟将含有抗NPV基因的家蚕品种亲本与含有耐氟基因的家蚕品种亲本杂交，对其后代进行抗NPV和耐氟性筛选，并累代添毒添氟以提高个体的抗病性和耐毒性，采用系统选育的方法选育出兼抗血液型脓病和耐氟化物的家蚕品系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

家蚕母种NC99R与96均由广西蚕业技术推广站育成并保存，均为二化性中系品种。其中NC99R携带抗NPV显性主效基因，为抗家蚕血液型脓病品种桂蚕N2的亲本之一；96携带耐较高浓度氟化物显性主效基因，为耐氟化物品种桂蚕F95的亲本之一。

1.2 饲育方法

96·NC99R和对照932均在平均温度29 ℃、平均湿度81%的饲育环境中饲育，1龄～3龄全覆盖育，4龄半覆盖育，5龄普通育，每天3回育，并调查龄期经过、簇中经过、饲育成绩和茧质成绩。

1.3 抗NPV性筛选与提升

将提纯的NPV病毒原液稀释成3×106个/mL备用（随配随用）。添食当天摘取新鲜适熟叶，浸泡入制备好的NPV病毒液中，充分浸渍均匀，取出后待桑叶表面水分自然蒸发后，切成4 cm×4 cm的方块。2龄饷食第一口叶开始定量添食，每30 头蚕在24 h内一次性喂给4 cm×4 cm的浸渍过NPV的桑叶3 片，待24 h食尽后用新鲜石灰粉消毒蚕座，更换蚕座纸，开始换为普通桑叶正常饲喂，3龄起蚕后淘汰掉不抗NPV的病蚕。

1.4 半数致死浓度（LC50）的测定

将NPV病毒原液稀释成1×104个/mL、1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL和1×109个/mL共6 个浓度，添食方法同1.3。3龄第2天开始统计死亡与存活的蚕头数，每个浓度梯度攻毒2 个重复区，每个重复区30 头蚕。

1.5 耐毒性筛选与提升

准确称取氟化钠（NaF）分析纯试剂3 g，加入10 kg清水稀释后得到300 mg/L的NaF溶液，NaF溶液宜即配即用。将新鲜适熟桑叶浸入300 mg/L的NaF溶液中，充分浸渍10 min后捞出晾干备用。自3龄饷食至3龄眠下，连续添食制备好的含氟桑叶（实测含氟量237 mg/L），过程中选留不出现氟化物中毒症状的家蚕个体。

1.6 统计分析

获得的实验数据通过MicrosoftExcel 2007软件录入和处理，半数致死浓度的计算参考Reed-Muench法。添食NPV病死率与虫蛹率的显著性分析用卡方检验进行计算，所用软件为SPSS 24.0。

2 结果与分析

2.1 品系96·NC99R的选育

以含有耐氟化物基因载体的家蚕母种96为母本、以含有抗NPV基因载体的家蚕母种NC99R为父本，杂交的后代（暂命名为96·NC99R）为F1代。为了固定新品系的耐氟能力，再以96为父本连续回交3次，使后代中耐氟化物品种的理论遗传成分占93.75%，抗NPV品种的理论遗传成分占6.25%（见表1）。

表1回交后代群体中2个亲本的遗传成分理论值

饲养时间回交次数世代亲本遗传成分占比/%回交后代基因型组成NC99R96 2017.30F15050NnFf 2017.51BC12575NnF_ 2017.62BC212.587. 5NnF_ 2017.93BC36.2593.75NnF_

注：含有抗NPV主效基因的家蚕品种的基因型为NNff，含有耐氟化物主效基因的家蚕品种的基因型为nnFF，其中N对n为显性，F对f为显性，F_表示基因型为FF或Ff。

最后一次回交的后代设定为B1世代，从B1世代开始，进行抗病性和耐毒性的选拔提高。2龄饷食经口添食NPV攻毒筛选抗性个体，3龄期添食含氟桑叶筛选耐毒性个体（详见材料与方法1.3和1.5）。B1～B6世代全部混区饲养，混区制种。

2.2 抗血液型脓病的鉴定

在添食NPV浓度为106个/mL的数量级下，品系96·NC99R与对照932的死蚕率见表2。品系96·NC99R的病死率平均为7.14%，对照932的病死率平均为69.91%[12]，差异极显著（<0.01），说明96·NC99R的抗NPV性高于932，两个品系的抗病性有差异，且差异极显著。将NPV病毒原液稀释成1×104个/mL、1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL和1×109个/mL的6个浓度进行添食处理（结果如表3所示），按Reed-Muench法计算出品系96·NC99R的半数致死浓度为2.19×108个/mL。

如表4所示，在蚕室受NPV污染的情况下饲养，96·NC99R的虫蛹率为43.93%，而对照932的虫蛹率为6.94%，差异极显著（<0.01）；在正常情况下饲养，96·NC99R的虫蛹率为89.41%，而对照932的虫蛹率为90.25%，差异不显著（>0.05）。可见在正常情况下，96·NC99R的虫蛹率和对照932不相上下，而在遭受NPV污染的情况下，96·NC99R的虫蛹率与对照932的虫蛹率差异极显著，而且新品系的虫蛹率要高于对照932，说明96·NC99R的抗NPV性优于对照932。

表2品系96·NC99R与对照的抗病性比较

品种名NPV浓度/个/mL死蚕数活蚕数死蚕率/% 96·NC99R3×1064527.14 对照932[12]3×10641718069.91

注：对照932的实验数据摘自文献《家蚕抗氟品种“桂蚕F95”的选育研究》[12]。

表3品系96·NC99R添食NPV梯度浓度的实验结果

病毒稀释度/个/mL1×1041×1051×1061×1071×1081×109 接毒蚕数273029263026 活蚕数252525212420 NPV死蚕数254566

表4品系96·NC99R与对照932的饲养情况比较

饲养条件虫蛹率/% 96·NC99R对照932 蚕室正常情况89.4190.25 蚕室受NPV污染43.936.94

2.3 耐氟化物的鉴定

3龄起蚕淘汰掉不抗NPV的家蚕个体后，就开始进行氟化物的添食筛选（详见材料与方法1.5）。从图1中可以看出，添食氟化钠后，96·NC99R和932都出现了环节凸起等氟中毒现象（图1中C和D），但932的蚕头数明显比96·NC99R少，而且蚕个体明显比96·NC99R瘦小，发育不齐（图1中A和B）。在添食NPV又连续添食氟化钠后，932蚕无法结茧化蛹，表现出更严重的氟化物中毒症状。

（A、C：添食氟化物后的96•NC99R。B、D：添食氟化物后的932。）

3 讨论

本研究用两个抗性亲本杂交，使得抗NPV显性基因与耐氟显性基因均整合至96·NC99R上，为巩固F1代的耐氟性又与96亲本进行连续三代回交，回交后代在高温多湿环境下饲养，通过累代添氟添毒，选拔抗性个体进行留种继代，以提升新品系的抗病性和耐毒性。

试验结果表明，新品系的食下感染半数致死浓度为2.19×108个/mL，比它的抗病亲本NC99R低[8]。在添食NPV浓度为106个/mL的数量级下，新品系96·NC99R的病死率比两广二号的亲本932低62.77%，差异极显著（<0.01），说明品系96·NC99R与932的抗病性有极显著差异。在正常情况下饲养，96·NC99R的虫蛹率比932低0.84%，差异不显著（>0.05）；在蚕室遭受NPV污染的情况下，96·NC99R的虫蛹率比932高36.99%，差异极显著（<0.01），说明96·NC99R与932的虫蛹率可能存在差异，但差异还未达到显著水平。而96·NC99R的抗病性与932的抗病性差异极显著，说明品系96·NC99R含有抗NPV主效基因，对NPV有相当好的抗性。3龄起蚕至3龄眠下连续添食含氟桑叶，进行耐氟性筛选，通过累代筛选出耐氟化物个体留种继代，可以逐步提升96·NC99R品系的耐氟性。

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2095-1205(2021)08-01-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2021.08.01