涤痰汤对血管性痴呆大鼠海马TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-10表达的影响

杨超 杨佳 刘玲

(1湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2湖北省中西医结合医院老年病科；3华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科；4湖北中医药大学第一临床学院)

涤痰汤治疗血管性痴呆(VD)疗效确切，但其作用机制尚不明确。脑缺血引起的炎症反应在VD的发生发展过程中扮演了重要角色〔1〕。本实验通过观察涤痰汤对VD大鼠海马组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB、白细胞介素(IL)-1β、IL-10表达的影响探讨其治疗VD的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康Wistar大鼠40只，鼠龄8～10 w，雄性，体重(200±20)g，购自湖北省疾控中心，许可证编号：SCXK(鄂) 2008-0004。

1.2药物和试剂 涤痰汤由制半夏8 g，天南星8 g，橘红5 g，炒枳实6 g，茯苓6 g，人参3 g，竹茹2 g，石菖蒲3 g，甘草1.5 g，生姜5 g组成，购于湖北省中医院，分别水煎浓缩成含生药量0.971 g/ml、0.485 g/ml，无菌分装后备用。一抗兔抗大鼠TNF-α和兔抗大鼠NF-κB抗体(abcam公司，英国)、二抗山羊抗兔抗体(abcam公司，英国)；苏木素-伊红(HE)染色所需试剂由国家中医药管理局老年性痴呆(醒脑益智)重点研究室提供；IL-1β、IL-10试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3仪器 RM2235自动切片机(德国徕卡)，SA201 Morris水迷宫视频分析系统(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，KZ-Ⅱ型匀浆仪(康涛科技有限公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，V300型扫描仪(EPSON)，722S型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4造模 动物适应性喂养1 w后，采用改良的永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型：大鼠术前6 h禁水，12 h禁食，给予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，剪去颈前部手术区域毛发，消毒，钝性分离左侧颈总动脉，用0号手术线结扎左侧颈总动脉的近心端和远心端，用剪刀从中间剪断，依次逐层缝合。缝合后于手术切口局部皮下注射庆大霉素0.2万U预防感染。1 w后在同样条件下，结扎并剪断右侧颈总动脉。假手术组分离双侧颈总动脉，但不结扎。

1.5分组与给药 将40只大鼠随机分为VD模型组、假手术组、涤痰汤高剂量组、涤痰汤低剂量组，每组10只，造模成功1 w后开始灌胃给药，给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定。涤痰汤低、高剂量组给药量为涤痰汤折合生药量4.85 g/kg、9.71 g/kg，模型组、假手术组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续4 w。

1.6检测方法

1.6.1Morris水迷宫测试 水迷宫实验的前1～5 d为定位航行测试，第6天为空间搜索实验。定位航行测试：将各组大鼠按照顺时针的顺序从水池的四个象限放入水中，记录120 s内大鼠从入水到找到平台后四肢爬上平台并停留超过10 s所需的时间(即逃避潜伏期)，每天4次，连续5 d，取平均值。空间搜索实验：第6天，将平台撤除，将大鼠由任意象限放入水中，记录大鼠在120 s内跨越原平台的次数及停留时间。

1.6.2海马组织形态学观察 Morris水迷宫结束后当天断头处死大鼠，冰上迅速取脑组织，留取包含完整海马的脑段，置于4%多聚甲醛中固定，然后经过脱水、包埋后，制作成4 μm左右厚度的切片，再经过HE染色后观察海马组织学改变。

1.6.3免疫组化法检测核因子(NF)-кB的表达 将上述各组石蜡切片用SP法进行免疫组织化学染色，其方法严格按照试剂盒说明进行。组织中棕黄色或棕褐色颗粒为目标蛋白。在光学显微镜下，每张片子随机选取 5 个视野，采用 Leica Qwin 图像分析系统分析目标蛋白NF-кB的表达情况(表达平均灰度=视野灰度 × 阳性细胞比率)。

1.6.4Western印迹法检测海马组织肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达 每组称取100 mg海马组织，剪碎、匀浆、离心后，收集上清液，后用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，再进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜后，在室温下将膜置于脱色摇床上用5%的脱脂牛奶，封闭2 h。封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。之后加入1∶3 000稀释二抗，室温下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次10 min。电化学发光(ECL)化学显影、定影及曝光后，Alpha软件处理系统对目标条带进行分析。

1.6.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测海马组织白细胞介素(IL)-1β、IL-10含量 取大鼠海马组织1 g，按1∶9(大鼠海马组织∶生理盐水体积)加入冰生理盐水，充分研磨制备成海马组织匀浆。4℃，2 500 r/min离心10 min，吸取上清液，即为海马组织匀浆。加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 100 μl，余孔分别加标准品或待测样品 100 μl，轻轻晃动混匀。弃去液体，甩干。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μl。酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min。每孔加酶结合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液(TMB)90 μl，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育15 min左右。每孔加终止液50 μl。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 大鼠定位航行实验结果：与假手术组比较，模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤低剂量组、涤痰汤高剂量组的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05，P<0.01)。空间探索实验结果：与假手术组比较，模型组停留时间及穿越原平台次数明显减少(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤低、高剂量组停留时间及穿越原平台次数显著增加(P<0.05，P<0.01)。与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组停留时间及穿越原平台次数显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组水迷宫实验结果比较

2.2海马组织病理学观察结果比较 假手术组海马区神经元染色均匀，形态饱满，边界清晰，数量正常，细胞核呈类圆形，细胞膜、核膜清楚。模型组海马区神经元染色不均匀，细胞形态不规则，细胞边界模糊，数量减少，可见坏死的神经元，细胞核固缩，细胞膜、核膜不清晰。与模型组对比，涤痰汤低剂量组、高剂量组神经元染色较均匀，细胞形态较规则，细胞边界较清晰，数量增多。见图1。

图1 各组大鼠海马组织病理学形态(HE，×400)

2.3NF-кB的表达结果比较 与假手术组相比，模型组NF-кB表达量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤低剂量组、涤痰汤高剂量组NF-кB表达量显著下降(P<0.05，P<0.01)；与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组NF-кB表达量显著下降(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组海马NF-кB表达灰度及TNF-α相对表达量比较

图2 各组海马NF-кB蛋白表达比较(DAB，×400)

2.4海马组织TNF-α表达水平 与假手术组比较，模型组TNF-α的表达量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤低剂量组、涤痰汤高剂量组TNF-α表达量显著下降(P<0.05，P<0.01)；与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组TNF-α表达量显著下降(P<0.05)。见表2、图3。

图3 各组海马TNF-α蛋白的表达

2.5海马组织IL-1β、IL-10含量检测结果比较 与假手术组相比，模型组海马组织匀浆IL-1β、IL-10含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤低剂量组、涤痰汤高剂量组IL-1β含量降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10含量显著升高(P<0.05，P<0.01)；与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组IL-10含量显著升高(P<0.05)，IL-1β含量显著下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组海马组织匀浆IL-1β、IL-10含量比较

3 讨 论

VD属于中医学“文痴病”、“愚痴病”、“呆痴病”等疾病范畴，清代陈士铎在《辨证录》中说：“痰积于胸中，盘踞于心外，使神明不清而成呆病矣”，认为痰浊在痴呆的发病中具有关键作用。其所创立的治呆诸方皆以逐痰健脾为要。现代学者通过临床研究发现VD患者的认知障碍与中医痰浊密切相关〔2,3〕。作为中医治疗痴呆的经典方剂涤痰汤，可逐痰开窍、安神定志治疗痴呆。本实验研究表明涤痰汤可改善VD大鼠的认知功能障碍，保护VD大鼠海马神经元。这与我们的前期临床研究结果相一致〔4,5〕。作为VD的重要病理学基础，慢性脑缺血可引起脑组织炎症反应，损伤大脑神经元导致认知功能下降〔6～8〕。脑缺血发生后，局部内皮细胞、神经元等被激活，释放IL-1β、TNF-α等炎性因子，进一步刺激其他炎性因子的释放，并诱导炎症细胞进入损伤的脑组织，引发炎症级联反应，造成神经元损伤〔9,10〕，引起认知障碍。本实验表明IL-1β、TNF-α参与了VD大鼠海马缺血损伤，导致了认知障碍；涤痰汤可能通过抑制IL-1β、TNF-α的表达减轻海马神经元损伤从而改善认知障碍。IL-1β、TNF-α等炎性因子也参与调节突触可塑性，与VD的发病密切相关〔11,12〕。NF-кB是炎症反应中重要的核转录因子。脑缺血时，IL-1β、TNF-α等刺激NF-кB迅速活化，后者进入细胞核内，与多种炎性反应基因的启动子结合，促进炎性因子的表达，引起海马区炎症反应，损伤神经元〔13,14〕，引起海马损伤及神经元-突触丢失，最终导致认知障碍〔15〕。本实验表明VD的缺血损伤可能导致NF-кB的活化，促进海马组织炎症反应。经涤痰汤治疗后NF-кB的表达下降，表明涤痰汤可能通过抑制NF-кB的表达缓解海马组织炎症提高认知水平。IL-10作为脑缺血后小胶质细胞产生的抗炎因子〔16〕，可通过抑制缺血后的炎症反应发挥神经保护作用〔17〕，研究表明调高IL-10的表达与改善缺血后认知障碍密切相关〔18〕。本实验中，模型组IL-10的表达较假手术组升高，体现了IL-10的保护效果，但其仍不足以对抗其他众多促炎因子的作用，导致抑炎因子与促炎因子之间的动态平衡被打破和炎症反应的发生。在给予涤痰汤后，VD大鼠海马组织中IL-10的含量升高，进一步增强了抑炎因子的作用，缓解了大鼠海马组织的损伤，改善VD大鼠认知障碍。