HS-SPME-GC/MS分析3种牡丹花瓣挥发性成分

赵梦瑶，张立攀，王春杰，关炳峰，李 冰，王俊朋，王 永

（河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州 450000）

牡丹（Paeonia sufruticosaAndr.），又名富贵花、百两金等，是我国传统木本观赏植物，为毛茛科芍药属灌木。牡丹颜色艳丽，雍荣华贵，历来有“国色天香”、“花王”的美誉，被誉为“花中之王”[1]。牡丹原产于我国，资源丰富，品种繁多，在洛阳、菏泽和兰州等多个地区都有大面积种植，有着极佳的观赏、研究价值。牡丹花中含有维生素、氨基酸、糖类、矿物质以及黄酮等多种对人体有益的营养元素和功能性成分，使其还具有很高的食用、药用保健价值[2−4]。在牡丹产地，人们有食用牡丹花的历史，常将其制作为茶饮、粥品、牡丹花饼、牡丹花酱等。2013年国家卫计委批准‘丹凤’牡丹花成为新食品原料，开启了牡丹花食品产业的崭新链条。

香味是衡量食品质量的重要指标，人们在选择食品的过程中，常常会将香味作为主要的参考依据,食品的香味诱人，能够在很大程度上提升其受欢迎程度。因此，现代食品工业中，科学使用香精是一项非常重要的手段[5−6]。目前市场上牡丹相关食品多存在牡丹特征风味不足的问题，在很大程度上影响和限制了牡丹花食品产业的发展，急需进行牡丹花香精的开发。解析牡丹香味组分，确定香味组分构成是研制香精产品的重要环节。但目前对牡丹的研究，多集中于牡丹苗木育种、籽油、丹皮的生产和精油的提取工艺[7−10]，关于牡丹香气组分的研究相对较少。

固相微萃取是在固相萃取的基础上发展而来的一种新型样品前处理技术，兴起于上世纪90年代，集采样、萃取、浓缩、进样于一体[11−13]。其分析过程简单、快速，分析结果与原始气味更加接近，近年来被广泛用于挥发性物质的分析[14−15]。本研究采用HS-SPME-GC/MS分析手段，对‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’3种品种的牡丹花瓣挥发性成分进行分析，从分子水平对牡丹花的香气物质进行解析，阐明不同品种牡丹花瓣香气组分，并结合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）统计分析方法，寻找3种品种牡丹花瓣香气差异成分，为研制牡丹香精提供依据，更好地促进牡丹花食品产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡丹（‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’） 采自河南省洛阳祥和牡丹科技有限公司牡丹种植基地；正构烷烃C5～C25美国o2si 标准品公司；甲醇（HPLC级）北京迪马科技有限公司。

电子天平（FA 2004） 上海衡际科学仪器有限公司；水浴锅（DF101S） 江苏科析仪器有限公司；手动SPME进样器、萃取纤维（65μmPDMS/DVB）美国Supelco公司；7890A-7000GC/MS Triple Quad 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡丹花瓣挥发性成分的提取 准确称取3 g新鲜花瓣置于40 mL顶空瓶中密封，50°C水浴下平衡20 min，将老化过的固相微萃取进样针插入密闭的顶空瓶中，推出萃取头在50°C下吸附30 min，取出后立即插进气质联用仪进样口中，解析5 min。平行进行三次实验，结果求平均值。

1.2.2 GC-MS分析条件 色谱柱为HP-5MS（30 m×250μm×0.25μm），采用程序升温模式，起始温度为40°C，保持1 min，以3°C/min速率升至100°C，保持2 min，再以2 °C/min速率升至110 °C，保持2 min，再以10°C/min速率升至270°C。流速1 mL/min。进样口温度250°C；以He（99.999%）为载气，流速1.0 mL/min；分流比为5:1。

离子源温度230 °C，电离方式EI，电离能量70 eV；四极杆温度150°C，传输线温度250°C，无溶剂延迟，质量扫描范围为33～450 amu，采用全扫描模式。

C5～C25正构烷烃采取分流模式进样1μL，分流比为20:1。其他进样条件与样品进样一致。计算保留指数（retention index，RI）如下:

式中：lgtn和lgtn+1分别为碳数为n，n+1的正构烷烃的保留时间的对数；lgti是出峰在n和n+1的正构烷之间的i化合物的保留时间的对数。

1.3 数据处理

通过GC-MS工作站自带的NIST 17谱库进行检索，再结合文献和人工解析，以及通过正构烷烃计算保留指数，与文献进行核对，进行定性分析，采用面积归一化法，求出化合物的相对含量。通过SPSS22.0进行ANOVA分析，SIMCA 14.1进行PCA和OPLSDA分析。

2 结果与分析

2.1 牡丹花瓣香气成分HS-SPME-GC/MS分析

‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’花瓣中挥发性成分的GC-MS分析总离子流色谱图见图1。

图1 ‘丹凤’（A）、‘香玉’（B）和‘海黄’（C）花瓣GC/MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of GC/MSfor Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang (A), Paeonia suffruticosa‘Xiang yu’(B)and ‘P.High Noon’(C)

表1为‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’花瓣香气成分GC-MS分析的结果，通过HP-5MS色谱柱的分析，根据检索NIST 17谱库，与文献核对保留指数、查阅相关文献鉴定化合物。3种品种牡丹花瓣中共检测鉴定出115种化合物，包括醛类20种、酮类3种、醇类27种、酸类2种、酯类22种、烷烃类13种、烯烃类17种和其他类11种。

表1 ‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’花瓣HS-SPME-GC/MS分析结果Table 1 Analysisresultsof Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang , Paeonia suffruticosa‘Xiang yu’and ‘P.High Noon’ by HS-SPME-GC/MS

绘制3种牡丹花瓣挥发性成分的维恩图如图2所示。

图2 3种花瓣挥发性成分维恩图Fig.2 Venn diagram of the volatile components in three Paeonia petals

从图2可以更加直观地看出3种牡丹花瓣挥发性成分之间的相互关系。在检测鉴定出的115种化合物中，共有成分有33种，重合率仅为28.7%，说明3种牡丹花瓣成分差异较大。‘丹凤’和‘香玉’的共有成分有44种，‘丹凤’和‘海黄’的共有成分有58种，‘香玉’和‘海黄’中的共有成分有36种。‘丹凤’中有15种成分为其他两种牡丹花瓣中所不具有的，为其特征挥发成分。‘香玉’中有12种特征挥发成分。‘海黄’中有16种特征挥发成分。

从单独的牡丹花品种来看，‘丹凤’中共鉴定出84种，‘香玉’中58种，‘海黄’中77种。‘丹凤’中含量较高的主要化合物由高到低为醛类、醇类、其他类、烷烃类和烯烃类，含量前十的化合物为橙花醇、1,3,5-三甲氧基苯、柠檬醛、橙花醛、（E）-肉桂醛、香茅醇、β-罗勒烯、（E）-2-壬烯醛、十五烷、十七烷。‘香玉’中含量较高的主要化合物由高到低为醇类、其他类、烷烃类、酯类和烯烃类，含量前十的化合物为香茅醇、1,3,5-三甲氧基苯、十五烷、苯甲酸乙酯、大牛儿烯、十七烷、十三烷、β-罗勒烯、顺-9-十四碳烯、十四烷。‘海黄’中含量较高的主要化合物由高到低为烯烃类、醇类、醛类、烷烃类、酯类。芳樟醇、（1S,4aR,8aS）-1-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氢萘、（E）-肉桂醛、十七烷、苯甲酸乙酯、二环大根香叶烯、橙花醛、柠檬醛、石竹烯、7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯-1-醇。

从不同品种间来看，‘丹凤’花瓣中醛类的含量为远远高于‘香玉’和‘海黄’。其中3种牡丹花瓣中均有的化合物为己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E）-2-壬烯醛、橙花醛和柠檬醛，含量之间均有显著性差异（P<0.05）。‘丹凤’中橙花醛和柠檬醛含量很高，分别为8.67%和9.43%，显著（P<0.05）高于‘香玉’和‘海黄’。柠檬醛具有柠檬的清香，存在于柠檬等多种芳香植物中[16−17]。橙花醛是一种常见的香气物质，是柠檬醛的同分异构体[18]。（E）-肉桂醛也存在于肉桂精油中，具有抗菌功效[19]。（E,Z）-2,6-壬二烯醛具有典型的黄瓜清香。苯甲醛具有杏仁味的气味。

续表1

续表1

酮类共检测鉴定出3种，在3种牡丹花瓣中含量都比较低。

醇类物质中3种牡丹花共同含有的化合物为3-甲基-1-丁醇、苯甲醇、芳樟醇、1-壬醇、顺-9-十四碳烯-1-醇。‘海黄’中芳樟醇的含量很高，为24.23%，显著高于另外两种牡丹花。芳樟醇具有青甜的花香气息，是薰衣草、兰花、茉莉花香气的主要挥发性成分，也是绿茶香气的主要成分，是目前食物、日化香精香料的主要来源[20−21]。橙花醇只在‘丹凤’和‘海黄’中鉴定出，且在‘丹凤’中含量很高，为15.14%。橙花醇具有较强的玫瑰和橙花香气，作为一类贵重香料广泛用于食品和化妆品等领域。香茅醇只在‘丹凤’和‘香玉’中鉴定出，在‘香玉’中含量高达51.19%。有研究表明香茅醇是芍药花挥发性物质中的特质成分。香茅醇具有淡甜的玫瑰味，可抑制霉菌饱子萌发和菌丝生长，在储粮保鲜和驱除害虫上具有很好的效果[22]。醇类物质在3种牡丹花中含量都比较高，对牡丹花香气贡献较大。袁琴琴等[23]在研究牡丹花茶汤的风味物质时，结果显示，醇类是含量最多的化合物，对香气有着较大贡献。

酸类物质仅检测鉴定出了苯甲酸和橙花酸两种。橙花酸可由花瓣中的橙花醇经氧化产生。

酯类物质中3种牡丹共同鉴定出的化合物有5种，分别为苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸异戊酸、十二酸乙酯和十六酸乙酯。苯甲酸乙酯的含量相对较高，在‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’中的含量分别为2.37%、3.54%和3.90%。酯类多具有花香、水果香气，由醇类和酸类通过酯化反应生成。苯甲酸乙酯具有似依兰油的花香气息[24]，是调配花香香精的常用香料物质。酯类物质对牡丹的香气具有重要贡献。

鉴定出的烷烃类物质多为3种牡丹花共有物质。其中十五烷和十七烷的相对含量较高。烯烃类物质中，在‘丹凤’和‘香玉’中含量较高的为β-罗勒烯和大牛儿烯。β-罗勒烯在‘丹凤’和‘香玉’中分别为5.32%和1.35%，大牛儿烯分别为1.93%和3.35%。这两种化合物在‘海黄’中均未检测到。在‘海黄’中含量较高的烯烃类物质为（1S,4aR,8aS）-1-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氢萘、二环大根香叶烯、石竹烯、葎草烯、δ-杜松油烯，含量分别为22.8%、2.84%、2.14%、1.62%、1.07%。烯烃类化合物中鉴定出的化合物多为萜烯类物质，这是一类以异戊二烯为基本结构单位的天然化合物，多存在于植物中。萜类参与多种植物激素的合成，在植物生长发育和抗逆等生物学过程中起重要的调节作用[25]。部分萜烯类化合物具有挥发性，对植物的香气起重要贡献作用，如石竹烯具有辛香、木香、柑橘气味、丁香香气[17]，这些香气物质多为植物精油的重要组分，[26]。

其他类化合物中，仅1,3,5-三甲氧基苯在3种牡丹花中均鉴定出，其含量在丹凤’和‘香玉’中较高，分别为11.34%、15.25%，而在‘海黄’中仅为0.12%。1,3,5-三甲氧基苯具有发酵后熟茶的甘醇沉香气息。以间苯三酚为最初的底物，经过3个酶催化形成最终芳香产物1，3，5-三甲氧基苯[27−28]。但反式-芳樟醇氧化物（呋喃型）仅在‘海黄’中检测出，含量为1.98%。草蒿脑具有大茴香样香气，常存在于芳香植物中。2-戊基呋喃具有青香、豆香，在茶叶香气中常检测到[29]。

2.2 主成分分析（PCA）

主成分分析能从总体上反映3种牡丹花瓣的成分差异及3种牡丹花之间的变异度大小。使用SIMCA 14.1对数据进行Par处理（即对数据中心化后除以列变量标准差的算术平方根）后进行自动建模分析见图3。

图3 3种牡丹花瓣香气成分PCA 分析Fig.3 PCA analysis of volatilecompoundsin three Paeonia petals

由图3所示，R2X=0.972，Q2=0.940，Q2≥0.5，说明模型拟合度较好。PCA模型能从总体上反映各组样本之间的总体差异及变异度，可用做分析3种牡丹花的聚集、离散程度。从图3可以明显看出3组牡丹花的分布及区间距离差异，说明品种间区别较明显，3种牡丹花瓣所含有的挥发成分差异较大。

2.3 不同牡丹花瓣中的差异成分分析

OPLS-DA作为一种有监督的降维、判别分析方法，通过正交化将数据信息中与类别信息无关（正交）的数据剔除，更容易排除与分类无关的自变量，筛选出各类样本的特征变量[30]。变量投影重要性（VIP）是一种筛选信息变量的评价指标，反映了OPLSDA模型对各个化合物的评分。一般认为，当VIP>1时，则表明该变量对于模型中类别的分类有着较为重要的意义[31]。采用OPLS-DA模型的主成分1的变量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）大于1来寻找差异成分，3种牡丹花的差异成分见表2。

如表2所示，‘丹凤’和‘香玉’之间的差异成分有12种，‘香玉’和‘海黄’之间差异成分有10种，‘丹凤’和‘海黄’之间有12种差异成分。‘丹凤’和‘香玉’差异成分中醛类物质较多，有5种，这些物质主要呈现青香、花香。这与‘丹凤’花瓣较‘香玉’花瓣青香味较重相一致。‘香玉’和‘海黄’之间的差异成分中含有2种醛、3种醇、2种烯烃。其中，（E）-肉桂醛具有肉桂的香气，使得‘海黄’的香气更加温润，柔和。醇类物质多具有甜香，差异成分中醇类物质较多，这与‘海黄’比‘香玉’在甜香香韵上较为突出有较大关系。‘丹凤’和‘海黄’之间差异成分中含有烯烃物质3种，醇类2种。差异成分中的两种醇为香茅醇和芳樟醇，分别具有淡玫瑰香气和青甜的花香气息，‘海黄’中芳樟醇含量远高于‘丹凤’，其香甜气也重于‘丹凤’。

表2 3种牡丹花香气物质差异成分Table 2 Differential components of three Paeonia petals

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC/MS手段对‘丹凤’、‘香玉’和‘海黄’3种不同品种牡丹花瓣中的香气物质进行了分析，共鉴定出115种化合物，发现牡丹花瓣主要挥发性组分为醛类、醇类、酯类和烯烃类物质。3种品种中‘丹凤’是化合物种类最为丰富的品种。PCA、OPLS-DA分析从3种品种牡丹花瓣香气组分中共筛选出19种差异成分，分别为（E,Z）-2,6-壬二烯醛、（E）-2-壬烯醛、橙花醛、（E）-肉桂醛、反式-芳樟醇氧化物（呋喃型）、芳樟醇、7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯-1-醇、柠檬醛、橙花醇、香茅醇、十五烷、3-苯基-2-丙烯-1-醇、反-草酸甲酯、1,3,5-三甲氧基苯、石竹烯、β-罗勒烯、大牛儿烯、（1S，4aR，8aS）-1-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-1,2,3,4,4a，5,6,8a-八氢萘、二环大根香叶烯。三种牡丹花中，‘丹凤’青香味较重，‘海黄’甜香香韵较为突出，‘香玉’青香和甜香均比较适中。

通过分析可知，3种品种牡丹花瓣香气成分在化合物种类和含量上都存在很大差异，综合表现在香气上，形成了不同品种牡丹独特的香气特点。对不同牡丹花瓣香气成分进行解析，找到构成香气的关键组分并确定其含量比例，对香精研制至关重要，但由于香气物质组成复杂，含量较低。有些香气物质虽然含量极微，但气味阈值很低，对香气贡献很大。因此，有待进一步采用嗅闻分析等手段筛选关键香气物质，以期开发出香气逼真的牡丹香精产品，促进牡丹食品产业的发展。