基于顶空气相-离子迁移色谱的不同品种番荔枝挥发性成分比较

杨涛华，张晴雯，龚 霄, ，李积华, ，周 伟

（1.中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东湛江 524001；2.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东湛江 524001）

番荔枝（Annona squamosaLinn.），为番荔枝科番荔枝属落叶乔木。果肉滋味甜，口感细腻绵密，营养丰富，是热带地区代表性水果之一。番荔枝风味独特，不同品种番荔枝挥发性化合物组成和含量不同，因此导致了番荔枝香气的品种间差异[1]，故而香气可以作为番荔枝分类的重要参考指标。

近年来，常用于鉴定食品中挥发性香气化合物的仪器分析技术主要有：气相色谱-质谱法（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS）[2]，气相色谱-嗅觉法-质谱（Gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）[3]和电子鼻[4]。但这些技术均受限于预处理程序和样品种类要求，无法满足快速检测分析的要求[5−6]。离子迁移谱（Ion mobility spectrometry，IMS）作为一种新兴技术具有许多优点，如检测速度快、灵敏度高、操作简便、样品制备步骤简单，将IMS与气相色谱结合使用可以更好地表征风味成分[7]。

气相色谱-离子迁移谱仪（Gas chromatographyion mobility spectrometry，GC-IMS）结合了GC的高分离能力和IMS的快速响应特性提供了一种新的气相分离和检测技术。已广泛用于食品风味分析、可卡因等非法药物的痕量检测[8]以及通过检测人呼出气体挥发性有机化合物和人类皮肤释放挥发性化合物监测和预先判别疾病[9−10]等，尤其是食品风味分析。不仅用于分析特征风味，如白葡萄酒的分类鉴别[11]，以蛋壳表面呼吸物的含量和浓度来判别鸡蛋的新鲜程度[12]，伊比利亚火腿的掺假鉴别[13]，枣果变黑过程中枣果实成分和挥发性化合物的含量变化[14]，还有将HS-GC-IMS成像与化学计量学和分子标记识别结合来区分不同花源蜂蜜和掺假蜂蜜[15]、山茶油掺假鉴别[16]、肉品分类[17]、番荔枝贮藏品质评价[18]等。在水果风味化合物分析领域，杨帆等[19]采用顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）和全二维气相色谱-嗅闻-质谱（GC×GC-0-MS）结合分别分析新鲜和热处理西瓜汁中的气味化合物，确定了2,6-二甲基-5-庚烯醛是西瓜产生甜瓜、清香气味的化合物，而包括戌醛、己醛、2-戊基呋喃、辛醛等化合物含量在热处理前后的变化则导致西瓜汁热处理后产生蒸煮味和含硫味。于怀智等[20]应用顶空气相离子迁移谱技术分析了不同产地水蜜桃挥发性有机物差异，通过建立相应的指纹图谱能较高效地鉴别不同产地水蜜桃。李湘等[21]基于气相色谱-离子迁移谱技术（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析不同处理前后柑橘果皮挥发性化合物变化，采用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）筛选出17个标志挥发性化合物（VIP>1），并对其进行热图聚类分析，发现了不同处理对柑橘果皮挥发性化合物的影响。事实证明，在水果等食品风味分析领域，GC-IMS以其高效无损、操作简单、灵敏度强的优势广泛应用于表征挥发性化合物[22−23]。因此，利用GC-IMS技术检测番荔枝风味物质，并根据特征风味化合物构建品种指纹图谱和鉴别模型是可以实现的。

本试验利用GC-IMS技术检测番鬼荔枝、大目番荔枝、红番荔枝、刺果番荔枝等4种番荔枝的香气成分，建立不同品种番荔枝挥发性风味物质指纹图谱。根据数据的差异性，对不同品种番荔枝进行区分，为番荔枝品种识别、全品种香气研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番鬼荔枝 采购于广东徐闻马以贸易有限公司；大目番荔枝 购于广西百色平果县；红番荔枝采购于广东徐闻马以贸易有限公司；刺果番荔枝 购于海南儋州翊盛贸易有限公司，采后全程冷链运输至实验室。

FlavourSpec®风味分析仪 德国G.A.S公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法 由于新鲜番荔枝果肉风味化合物不稳定、逸散不充分，易导致检测数据不稳定。且使用新鲜果肉进行挥发性化合物测定常以4-甲基-2-戊醇作为内标，对检测出的挥发性化合物进行相对定量，检测结果存在较大误差。因此本试验采用果肉速冻粉末进行风味分析。具体操作如下：番荔枝去皮，并将果肉快速切成薄片。将果肉液氮速冻并研磨成粉末，准确称量2.0 g粉末于20 mL顶空进样瓶中，用作香气试验。每个样品做三次平行试验。

1.2.2 GC-IMS检测条件 顶空孵化温度：60℃；孵化时间：10 min；孵化转速：500 r/min；顶空进样针温度：65℃；进样量：500μL，不分流模式；清洗时间：0.50 min；色谱柱为FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm，柱温60℃，色谱运行时间20 min，载气为高纯氮气（≥99.999%）；设置程序：流速2.00 mL/min，并保持2 min，在20 min内线性增至100.00 mL/min。IMS条件：IMS温度为45℃，载气为高纯氮气（≥99.99%）；流速150.00 mL/min。将顶空进样瓶中的样品进行孵化，使用加热的进样针抽取瓶内的顶空组分，GCIMS分析测定。定性定量方法：将IMS数据库里相应挥发性化合物的标准曲线作为参考基准，一一对应测定样品挥发性化合物的种类及含量。

1.3 数据处理

采用仪器配套的分析软件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC×IMSLibrary Search，进行多角度样品分析。LAV软件：用于查看分析谱图，图中每一个点代表一种挥发性有机物；对其建立标准曲线后可进行定量分析。Reporter插件：直接对比样品之间的谱图差异（二维俯视图和三维谱图）。Gallery Plot插件：指纹图谱对比，直观且定量地比较不同样品之间的挥发性有机物差异。Dynamic PCA插件：动态主成分分析，用于将样品聚类分析，以及快速确定未知样品的种类。GC×IMS Library Search：应用软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

风味物质浓度以μg/L表示。用GC-IMS测得风味物质的峰强度单位为ppb，将ppb作为浓度单位换算成μg/L，参考基准是IMS数据库里相应挥发性化合物的标准曲线。

采用软件SPSS V 20版（IBM SPSS Statistics 20）对数据进行显著性差异分析。处理三个平行数据并将其最终表示为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 不同品种番荔枝特征风味气相-离子迁移色谱（GC-IMS）谱图分析

图1、图2分别是LAV软件中Reporter插件所制作的三维谱图和俯视图。从三维谱图（图1）中可以直观看到四种番荔枝间含有挥发性化合物的种类及含量存在差异，除了独有的挥发性化合物外，四种番荔枝均有的挥发性化合物含量也不同。而在俯视图（图2）中：RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。图2中的物质编号对应表1中化合物。

图1 不同品种番荔枝果肉特征风味的GC-IMS三维谱图Fig.1 Three dimensional GC-IMSimagesof characteristic flavor of different Annona squamosa Linn. pulp

结合三维谱图和俯视图，能初步判断出刺果番荔枝（d）挥发性化合物的种类明显区别于其他三种，且挥发性化合物含量更为丰富。根据表1，同一种挥发性化合物的含量在不同品种番荔枝样品中存在显著差异。结合俯视图（图2）和番荔枝果肉挥发性物质表（表1）的分析可以得出，刺果番荔枝的风味成分以丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等酯类物质为主，且丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯几种成分在刺果番荔枝中的含量水平为300μg/L，远高于这几种成分在其它3种番荔枝为30μg/L左右的含量水平。而酯类能显著影响成熟水果的特征风味，给水果带来柑橘类清新香气[24−25]。番鬼荔枝、大目番荔枝和红番荔枝中则以柠檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯等萜烯类物质为主，而萜烯类物质给水果带来令人愉悦的玫瑰和柠檬香气[24−25]。柠檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯在番鬼荔枝、大目番荔枝和红番荔枝中含量（200～300 μg/L）远高于其在刺果番荔枝中的含量（3～10μg/L），且存在显著差异（P<0.05）。刺果番荔枝中萜烯类物质含量较低，含量水平处于0.25～3.5μg/L，因此刺果番荔枝无明显玫瑰和柠檬香气，这可作为快速判断刺果番荔枝的重要指标。

表1 番荔枝果肉挥发性化合物Table 1 Volatile compounds of Annona squamosa Linn.pulp

图2 番荔枝果肉特征风味的GC-IMS谱图Fig.2 GC-IMSimages of characteristic flavor of Annona squamosa Linn. pulp

2.2 不同品种番荔枝特征风味离子迁移色谱（GCIMS）指纹图谱分析

有机指纹图谱中每一行代表一个番荔枝果肉中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同番荔枝果肉中的信号峰。从图3中可以看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。

由图3可知：不同品种番荔枝果肉的挥发性化合物组分差异显著，均存在各自特征风味物质区域。番鬼荔枝（a）的特征风味物质，即菱形标记的芳樟醇（风信子香）、1,8-桉叶素、苯甲醛（苦杏仁香）、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物质，这些物质在番鬼荔枝（a）中含量较高，给其带来了风信子和苦杏仁香气；大目番荔枝（b）的特征风味物质，则是三角形标记的柠檬烯、月桂烯、莰烯（柔和樟脑香）、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇（生青、青草）、己醛、2-己酮、丙酮（薄荷香）、丁醛等物质含量较高；刺果番荔枝（d）的特征风味物质，即圆形标记的E-2-己烯醇（生青味、草药味）、丙酸乙酯、辛酸乙酯（果香，菠萝、梨香，花香）、丁酸己酯、辛酸甲酯（蜡味、苹果皮味、果香）、己酸乙酯（花香、果香）、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯（苹果、草莓、香蕉味）、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯（果香、苦味）、E-2-辛烯醛、1-辛醇（浓郁的柑橘、玫瑰）、3-甲基丁醇、2-庚酮（梨、香蕉味）、2-戊酮、乙酸乙酯（苹果味）、乙醇、3-甲基丁醛等物质含量较高；红番荔枝（c）的风味物质浓度较低，番鬼荔枝、大目番荔枝、红番荔枝中存在较多的萜烯类物质，而刺果番荔枝则以酯类物质为主，与Costa、Cheong等[26−27]的研究结论相一致。

图3 番荔枝果肉特征风味的指纹图谱Fig.3 Fingreprients information of characteristic flavor of Annona squamosa Linn.pulp

不同挥发性化合物组分会让样品呈现不同的香气感受。芳樟醇会带来风信子[28]的香气，1-己醇、丙酮、E-2-己烯醇会给样品带来青草、薄荷等草本类植物香气[28]。而辛酸乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、1-辛醇、2-庚酮、乙酸乙酯常被描述为花果类香气[29]。

2.3 不同品种番荔枝特征风味主成分分析

采用LAV软件Dynamic PCA插件，对番荔枝果肉样品进行主成分分析（PCA），观察图4A可得：前两个主成分上方差累计贡献率91.986%，其中第一主成分（PC1）是73.285%，第二主成分（PC2）是18.701%。在主成分分析图中，可以直观看到四种番荔枝各自聚类，区分度明显。

由样品风味物质的得分与载荷图即图4B中可知，刺果番荔枝（d）与酯类和酮类化合物距离较近，说明刺果番荔枝（d）中酯类、酮类化合物含量较高，更多地呈现出花果类香气；番鬼荔枝（a）与苯甲醛等醛类化合物距离较近，即番鬼荔枝（a）中苯甲醛含量较高，而苯甲醛通常表现为苦杏仁香气；蒎烯、松油烯、罗勒烯、月桂烯、柠檬烯、莰烯等萜烯类化合物与红番荔枝（c）位置接近，说明红番荔枝（c）含有上述多种的萜烯类化合物，因此香气以萜烯类化合物呈现的草本类香气为主。

图4 番荔枝风味成分得分与载荷图Fig.4 Score and load chart of aroma compounds of Annona squamosa Linn.samples

3 结论与讨论

本试验利用GC-IMS技术检测番荔枝香气成分，通过对番鬼荔枝、大目番荔枝、红番荔枝、刺果番荔枝四个不同品种番荔枝香气成分的分析和比较，确定了各品种特征香气成分以及特征信号峰。研究发现：在番鬼荔枝中，芳樟醇、1,8-桉叶素、苯甲醛、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物质含量较高；而柠檬烯、月桂烯、莰烯、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇、己醛、2-己酮、丙酮、丁醛等物质在大目番荔枝中含量较高；刺果番荔枝中E-2-己烯醇、丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯、E-2-辛烯醛、1-辛醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、2-戊酮、乙酸乙酯、乙醇、3-甲基丁醛等物质含量较高。红番荔枝的风味物质浓度较低。参考利用挥发性有机物差异鉴别水蜜桃产地[20]的研究思路，进一步对数据进行多元统计分析，发现PCA能基于香气成分对番荔枝品种进行有效区分，4种番荔枝与其特征风味化合物各自聚类，结果显示番鬼荔枝、大目番荔枝、红番荔枝检出的挥发性化合物以萜烯类物质为主，而刺果番荔枝中酯类物质占比较大。

GC-IMS作为近年来食品风味化学领域热门的技术手段，已在酒类[11]、蜂蜜[15]、水果风味化合物检测[19−21]等方面进行了探索并得到了一些研究结论。本研究比较了番鬼荔枝、大目番荔枝、红番荔枝、刺果番荔枝的香气成分并构建了四种番荔枝香气成分指纹图谱，但截止目前，由于IMS数据库在番荔枝风味领域的数据还不完善，只定性定量出49种挥发性化合物，需要进一步检测其它不同品种番荔枝的风味物质，扩充番荔枝风味物质数据库，为构建全品种番荔枝风味物质提供数据基础。