明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液的制备及其抑菌效果研究

陈玉芹，李仲佰，姚敏，张芸，朱秋劲，杨清丹

1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.盘州市农业农村局，贵州 盘州 561601；3.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550001；4.贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州 贵阳 550001；5.贵州杨老奶食品有限公司，贵州 盘州 561601

0 引言

天然涂膜在食品保鲜领域中具有独特的优势，它可以改变表面微气调的环境，有效阻止汁液流失和隔绝外界微生物，从而达到防腐保鲜的目的[1].明胶指由多种氨基酸组成的具有蛋白质结构的大分子物质，是浅黄、透明、无味的胶质，具有可降解成膜的能力，可用于食品的涂膜或包装[2].明胶涂膜或包装主要作为水、氧气、光的屏障，防止食品脱水及脂质氧化，而添加各种活性物质可进一步提高其对食品的保护能力[3].壳聚糖通常是通过几丁质的碱性水解(部分脱乙酰)得到的可生物降解多糖，具有无毒、无味、可生物降解、广谱抑菌等特性[4].壳聚糖具有很强的水合能力及良好的成膜性能，能吸收细菌生长所需的营养物质，是制备抗菌涂料的良好选择[5].明胶和壳聚糖都是亲水性物质，具有良好的亲和力和相容性，可以通过分子交联形成可生物降解的生物膜[6].S.F.Hosseini等[7]研究证实，明胶与壳聚糖混合物的形成主要依靠基团之间的静电相互作用及氢键作用.

肉桂精油是从肉桂干燥树皮、树叶中提取的挥发油，具有浓烈的芳香及辛辣气味，作为一种食品添加剂或调味剂，应用广泛，美国食品药品监督管理局将其列为安全食物成分[8-9].大量研究中记载[10]，肉桂精油具有较强的抗菌活性，可有效抑制各种微生物(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，常作为天然食品防腐保鲜剂广泛应用于食品行业.然而，精油普遍存在水溶性较差、易挥发、香气强烈等特点，使其在食品行业中的应用受到极大限制.为了保留精油的抗菌活性，以及降低其对食品感官品质的影响，制备一种负载精油的运载体系十分必要[11].已有研究表明[12]，肉桂精油可被生物活性包装材料包埋，且能提高、延长其抗菌效果.

基于此，本研究拟以明胶与壳聚糖混合物为运载体系，添加具有抗菌效果的肉桂精油，制备具有抗菌保鲜效果的天然涂膜液，采用单因素试验与正交试验优化其制备工艺，并进一步通过抑菌圈法确定该天然涂膜液的抑菌效果，以期制得可用于传统发酵火腿生产过程的涂膜保鲜液，改善火腿发酵过程中存在的脂质过氧化、微生物生长严重等问题.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

壳聚糖(分析纯)(脱乙酰度95%，黏度200～400 mPa·s)、肉桂精油(食品级)、脂肪醇-聚氧乙烯醚(AEO-9，乳化剂，分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司产；明胶(食品级)，天津市科密欧化学试剂有限公司产；金黄色葡萄球菌、普通变形菌、液化沙雷氏菌，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；LB肉汤培养基、营养琼脂培养基、PCA平板计数琼脂培养基、MSA培养基，上海博微生物科技有限公司产.实验所用其他常规试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

便携式pH计，梅特勒-托利多国际有限公司产；TGL-15B型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产；DELSA Nano C 型Zeta电位及纳米粒径分析仪，美国贝克曼库尔特有限公司产；Spectra Max 190型酶标仪、HJ-2B型恒温测速磁力搅拌器，常州市金坛友联仪器研究所产；HH-3型电热恒温水浴锅、DHP-9162B型电热恒温培养箱，江苏科析仪器有限公司产.

1.3 实验方法

1.3.1 明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液的制备参考张力[13]丁香酚纳米微粒的制备工艺，并对S.B.Bao等[6]制备负载茶多酚壳聚糖纳米粒的明胶膜制备工艺进行改进，利用自组装法制备明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液.具体制备流程如下.

1)精确称取一定量的壳聚糖粉末和增塑剂甘油，于45 ℃恒温水浴锅中溶解于体积分数为1%的醋酸溶液中，制得质量浓度为3 mg/mL的壳聚糖溶液，室温下置于转速为800 r/min的磁力搅拌器搅拌过夜，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用.

2)精确称取一定量的明胶粉末和增塑剂甘油，于45 ℃恒温水浴锅中溶解于超纯水中，制得质量浓度为6 mg/mL的明胶溶液，室温下置于转速为800 r/min的磁力搅拌器搅拌30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用.

3)分别准确量取一定体积上述两种溶液，用注射器将明胶溶液缓慢滴入装有壳聚糖溶液的烧杯中，放入转子，室温下置于转速为800 r/min的磁力搅拌器搅拌30 min，即形成明胶-壳聚糖混合物，调节体系pH值至4.5，继续搅拌30 min，备用.

4)精确称取一定量的肉桂精油、三聚磷酸钠及AEO-9置于装有超纯水的烧杯中，放入转子，室温下置于转速为800 r/min的磁力搅拌器搅拌30 min，即得质量浓度为3 mg/mL的肉桂精油溶液，备用.

5)精确吸取一定量的肉桂精油溶液，缓慢滴入未调pH值的明胶-壳聚糖混合物中，放入转子，室温下置于转速为800 r/min的磁力搅拌器搅拌30 min后，调节溶液pH值至4.5，继续搅拌30 min，即得明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液.

1.3.2 肉桂精油标准曲线的绘制参考文献[14]绘制肉桂精油的标准曲线.精确称取肉桂精油23 mg，用体积分数为95%的乙醇定容于10 mL容量瓶中，摇匀，得质量浓度为2.3 mg/mL的肉桂精油溶液.分别精确量取上述溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL,用V(2 mol/L HCl)∶V(95%乙醇)=2∶1的混合溶液定容于10 mL容量瓶中.以V(2 mol/L HCl)∶V(95%乙醇)=2∶1的混合溶液为空白对照，在275 nm波长处测其吸光度，以肉桂精油质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制肉桂精油在此溶液体系下的标准曲线，得出肉桂精油标准曲线的回归方程为y=3.239 1x+0.064 3，R2=0.993 1.

1.3.3 肉桂精油包埋率的检测参考文献[14]检测明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液对肉桂精油的包埋率.精确吸取10 mL涂膜液于10 KDa的超滤离心管中，于12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，未被包埋的肉桂精油离心出外部离心管，取截留的肉桂精油微粒，并加入等体积的2 mol/L HCl溶液破碎，用体积分数为95%的乙醇溶液定容于10 mL容量瓶中.以不加精油的明胶-壳聚糖混合物用相同方法制备得空白对照，在275 nm波长处测其吸光度.包埋率的计算公式如下：

式中，m1为加入肉桂精油总质量/g；m2为游离的肉桂精油质量/g.

1.3.4 天然涂膜液粒径的检测使用Zeta电位及纳米粒径分析仪检测明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液的粒径.每个分析样品一式三份进行平行实验，结果取平均值.

1.3.5 天然涂膜液制备的优化通过单因素试验，研究明胶质量浓度(2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL)、壳聚糖质量浓度(2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL)、肉桂精油质量浓度(1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL)、乳化剂质量浓度(1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL)、交联时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、搅拌转速(600 r/min、700 r/min、800 r/min、900 r/min、1000 r/min)和体系pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)对涂膜液粒径及其对肉桂精油包埋率的影响.

在单因素试验基础上，选择壳聚糖质量浓度(A)、明胶质量浓度(B)、肉桂精油质量浓度(C)、乳化剂质量浓度(D)4个主要因素进行正交试验.正交试验因素与水平见表1.正交试验结果基于加权评分法进行分析，包埋率评分权重60%，粒径评分权重40%.

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels Table of orthogonal experiment mg/mL

1.3.6 抑菌效果的研究采用抑菌圈法[15]测定明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液对金黄色葡萄球菌、普通变形菌及液化沙雷氏菌3种腐败菌的抑菌效果.将指示菌菌液用冷却至40～50 ℃的LB半固体培养基稀释至106～107CFU/mL，倒平板；待培养基凝固后，放入灭菌的牛津杯，往牛津杯中注入200 μL天然涂膜液，于37 ℃培养箱中静置培养24 h，观察并测量抑菌圈大小.每个样品进行3次平行实验，结果取平均值.

1.3.7 数据处理方法采用SPSS 26软件进行数据分析，取置信度为95%水平测验方法进行显著性比较，并采用Origin 2019软件绘制曲线.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

涂膜液的粒径及其包埋率与所使用的技术，以及与所使用的包埋材料和被包埋的物体有关[12].6种单因素对天然涂膜液粒径及肉桂精油包埋率的影响如图1所示.

2.1.1 明胶质量浓度由图1 a)可以看出，当涂膜液体系中明胶质量浓度过低时，不能满足壳聚糖分子与明胶分子进行交联的最低要求[16]，使得体系对肉桂精油的包埋率较低.明胶分子与壳聚糖分子间发生规则性的静电作用，并且与肉桂精油分子发生有效的相互作用，通过分子间的非共价键作用对其进行包埋[17].当明胶质量浓度为6 mg/mL时，对肉桂精油的包埋率达到最大值42.65%，且与其他明胶质量浓度均具有显著差异(P<0.05)，此时体系粒径为227.17 nm.涂膜液体系中的明胶质量浓度继续增加，除与壳聚糖分子发生规则性的静电相互作用外，明胶分子间的相互作用力形成的网状结构导致体系的黏度增大，使得体系不稳定，从而导致对肉桂精油的包埋率降低.因此，选择明胶质量浓度为6 mg/mL作为后续正交试验的正交点.

2.1.2 壳聚糖质量浓度由图1b)可以看出，涂膜液的粒径随壳聚糖质量浓度的增加逐渐增大，这可能是因为涂膜液体系中壳聚糖分子增多，只能与有限的明胶分子交联，两者之间存在一对一、一对多的结合方式，导致体系的粒径逐渐增大[18].当壳聚糖的质量浓度为2 mg/mL时，涂膜液体系中的壳聚糖分子含量较少，除3种物质之间的相互作用对肉桂精油起包埋作用外，明胶作为一种已被广泛应用的壁材材料也会包埋一部分的肉桂精油[19-20].涂膜液体系中的壳聚糖分子增多，在酸性条件下被质子化带正电荷，在涂膜液体系平衡的范围内与明胶相互作用包埋肉桂精油分子，使得体系对肉桂精油的包埋率增大[13].当壳聚糖质量浓度为3 mg/mL时，包埋率达到最大值53.01%，与其他壳聚糖质量浓度的包埋率均有显著差异(P<0.05).壳聚糖质量浓度继续增大，体系对肉桂精油的包埋率又开始下降，这是因为涂膜液体系中的壳聚糖分子增加，使得体系的黏度增加，阻碍了体系内分子自由运动进行交联，导致包埋率降低.因此，选择壳聚糖质量浓度为3 mg/mL作为后续正交试验的正交点.

图1 6种单因素对天然涂膜液粒径及肉桂精油包埋率的影响Fig.1 The effect of six single factors on the particle size of natural film coating and embedding rate of cinnamon essential oil

2.1.3 肉桂精油质量浓度由图1c)可以看出，肉桂精油的质量浓度对涂膜液粒径及其自身被包埋率均有较明显的影响.向涂膜液体系中加入少量的肉桂精油，此时肉桂精油的质量浓度较低，未能与明胶、壳聚糖分子进行理想的相互作用，而是通过弱相互作用附着在明胶分子表面[21]，高速离心使得肉桂精油分子被分离，导致在低质量浓度时体系对肉桂精油的包埋率较低而粒径偏大.当体系中肉桂精油分子量增多时，体系中明胶、壳聚糖与肉桂精油三者配比达到最佳，此时溶液体系开始出现淡蓝色乳光，且伴随着体系粒径的减小及包埋率的增大.在肉桂精油为3 mg/mL时，包埋率达到最大值40.11%，体系粒径为224.06 nm，并与其他肉桂精油质量浓度均有显著差异(P<0.05).肉桂精油质量浓度继续增加，超过三者之间的最佳配比时，过量的肉桂精油分子影响肉桂精油与明胶分子之间的交联，明胶自身的网络结构被破坏，导致肉桂精油小分子从明胶/壳聚糖复合结构中流出，使得包埋率降低及体系粒径增大[22].因此，选择肉桂精油质量浓度为3 mg/mL作为后续正交试验的正交点.

2.1.4 乳化剂质量浓度精油是一种不饱和的小分子混合物，在水相中通过外界剪切力被分散，而乳化剂分散于油相与水相界面，可对精油液滴进行包覆[23].由图1d)可以看出，乳化剂质量浓度较低时，乳化剂在精油液滴表面较少，使其不能被完全乳化.当涂膜液体系乳化剂的质量浓度为3 mg/mL时，体系粒径达到最小值358.27 nm，对肉桂精油的包埋率达到最大值40.88%，与其他乳化剂质量浓度均具有显著差异(P<0.05).这可能是因为此时乳化剂质量浓度刚好能将肉桂精油完全乳化成极微小的液滴，从而被明胶/壳聚糖分子通过静电作用进行包埋.若乳化剂质量浓度继续增加，此时体系中乳化剂分子增多，除与肉桂精油发生乳化作用外，还会与溶液中的一些杂质发生反应，导致溶液体系趋于白色，使得体系粒径增大，对肉桂精油的包埋率降低.因此，选择乳化剂质量浓度为3 mg/mL作为后续正交试验的正交点.

2.1.5 交联时间由图1e)可以看出，涂膜液体系反应需要一定的时间过程，较短的时间不能使明胶、壳聚糖与肉桂精油分子之间发生交联反应[24].随着交联时间的延长，体系中的分子进行充分交联，在交联时间为30 min时，体系粒径达到最小值247.10 nm，对肉桂精油的包埋率达到最大值40.47%(P<0.05)，且稳定性良好.随涂膜液体系交联时间的延长，体系粒径逐渐变大，包埋率逐渐降低，这可能是因为长时间的磁力搅拌导致明胶与壳聚糖分子之间的体系黏度降低，对肉桂精油的包埋效果下降，分子间的交联反应过度，导致体系内的颗粒形状不规则，分散性不好[25].因此，确定交联时间30 min为该单因素制备天然涂膜液的最优条件.

2.1.6 搅拌转速由图1f)可以看出，当肉桂精油乳液滴加到明胶/壳聚糖体系中时，由于搅拌转速过低不能立即充分分散，造成体系中局部肉桂精油及明胶/壳聚糖质量浓度过高，不能发生有效交联反应，导致粒径偏大而包埋率偏小(P<0.05).当搅拌转速达到800 r/min时，体系的粒径达到最小值186.03 nm，包埋率达到最大值35.87%.当搅拌转速继续增大时，过高转速形成的剪切力破坏了分子的内部结构，使得部分化学基团不能发生有效相互作用，出现分子凝聚，导致对肉桂精油包埋率降低、涂膜液的粒径增大.因此，确定搅拌转速800 r/min为该单因素制备天然涂膜液的最优条件.

2.1.7pH值壳聚糖是一种碱性多糖，在中性或碱性条件下不溶解，其质子化程度与溶液的pH值密切相关[26].因此，溶液的粒径及其对肉桂精油的包埋均受体系pH值的影响[27].pH值对天然涂膜液粒径及肉桂精油包埋率的影响见表2.由表2可知，当pH值小于4.5时，溶液粒径和包埋率均随pH值的增大而增大；当pH值大于5.0时，体系开始出现白色絮状物，并且出现明显的分层现象.这是因为当pH值较高时，对体系分子间的交联反应有不利的影响.因此，确定pH值4.5为该单因素制备天然涂膜液的最优条件.

表2 pH值对天然涂膜液粒径及 肉桂精油包埋率的影响Table 2 The effect of pH value on particle size of natural film coating and embedding rate of cinnamon essential oil

2.2 正交试验结果分析

天然涂膜液的正交试验结果见表3.由表3可知，4个因素对天然涂膜液影响的主次顺序依次为明胶质量浓度、壳聚糖质量浓度、肉桂精油质量浓度、乳化剂质量浓度.最佳制备工艺的加权分数为92.56分，制备明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液的最优组合为A1B2C2D2，因此，制备明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液的最佳工艺为：壳聚糖质量浓度3 mg/mL，明胶质量浓度6 mg/mL，肉桂精油质量浓度3 mg/mL，乳化剂质量浓度3 mg/mL，并调节体系pH值至4.5，转速800 r/min，搅拌时间30 min.

表3 正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

2.3 验证实验结果分析

按上述最佳工艺制备明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液，测得该天然涂膜液的粒径及其对肉桂精油的包埋率分别为(236.54±18.32) nm和(46.78±2.61)%.这表明明胶-壳聚糖与肉桂精油中的化合物表现出良好的相互作用.Q.Wang等[4]的研究也得到类似结果：明胶-壳聚糖与具有抗菌效果的丁香酚、牛至精油之间具有良好的相互作用，对其包埋率可达到50%左右.

2.4 天然涂膜液的抑菌实验结果分析

不同处理组对3种腐败菌的抑菌效果见表4，其中对照组未添加肉桂精油.未添加肉桂精油的处理组对3种腐败菌均具有一定的抑菌效果，这可能与壳聚糖本身是一种具有广谱抑菌性的多糖有关[28].添加肉桂精油的处理组对3种腐败菌的抑菌效果均显著增加(P<0.05).精油作为具有抗菌效果的添加剂，已被广泛应用于蔬菜、水果、肉制品及乳制品中[29].本研究结果表明，明胶-壳聚糖可以对精油进行有效包埋，从而提高天然涂膜液的抑菌效果.

表4 不同处理组对3种腐败菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect on three spoilage bacteria in different treatment groups mm

3 结论

本文采用自组装法制备明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液，以天然涂膜液的粒径及其对肉桂精油的包埋率为衡量指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验得到天然涂膜液的最佳制备工艺为壳聚糖质量浓度3 mg/mL，明胶质量浓度6 mg/mL，肉桂精油质量浓度3 mg/ml，乳化剂质量浓度3 mg/mL，且调节体系pH值至4.5，转速800 r/min，搅拌时间30 min.在此最佳工艺条件下，天然涂膜液的粒径为(236.54±18.32) nm，对肉桂精油的包埋率为(46.78±2.61)%.采用抑菌圈法研究明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液对金黄色葡萄球菌、普通变形菌及液化沙雷氏菌3种腐败菌的抑菌效果发现，该天然涂膜液对普通变形菌、液化沙雷氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(13.19±0.32) mm、(14.04±0.07) mm和(14.89±0.45) mm，抑菌效果均优于壳聚糖组和明胶-壳聚糖组，即肉桂精油的添加提高了明胶-壳聚糖涂膜液的抑菌效果.本研究制备得到的具有良好抑菌效果的明胶-壳聚糖-肉桂精油天然涂膜液，为其作为涂层材料应用于传统发酵火腿的发酵过程提供了参考.