博落回提取物对猪场常见4种病原细菌的体外抗菌活性研究*

韩佃刚，杨宏清，信吉阁，车丽涛，张春勇，杨云庆，董 俊，郭荣富

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南 昆明 650201；2.昆明海关技术中心，云南 昆明 650200；3.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201；4.宜宾学院 农林与食品工程学部，四川 宜宾 644000)

抗生素自问世以来在保护人类和动物健康方面发挥了重要作用。1950 年代以来，养殖业开始使用亚治疗剂量的抗生素作为促生长的饲料添加剂[1]。然而，自从抗生素促生长剂最初用于家畜生产以来，从家畜中分离出耐抗生素细菌的病例越来越多[2-4]。抗生素的滥用、抗生素残留以及细菌耐药性的产生引起了世界范围内的广泛关注，很多国家或地区开始限制或完全禁止在饲料中添加抗生素，欧盟于2006 年全面禁止抗生素类促生长剂的使用，美国和加拿大也正在逐步限制饲料抗生素的使用，中国于2020 年7 月1 日开始全面禁止在饲料中添加抗生素。禁止在饲料中使用抗生素会导致家畜的感染率上升，从而降低畜产品的供应。为了维持全球养殖业的稳定发展和保证全球的肉类食品供应，研究和开发有效的抗生素替代技术，是饲料行业可持续发展的必经之路[5]。

研究人员正在加紧研究在不产生耐药性的情况下提高动物健康的抗生素替代方案，其中药用植物因其易降解无残留、不易产生耐药性和天然成分对环境污染小等独特优势引起了研究人员的关注。药用植物在许多国家的医学实践中发挥着作用，如中国的传统医学、印度的阿育吠陀医学和尤纳尼医学。直至今天，药用植物的使用仍然很普遍，约有80%的世界人口依赖药用植物产品和补充剂作为主要的药物来源[6-7]。博落回(Macleaya cordata)作为多年生草本药用植物，生物碱是其主要活性成分[8]。到目前为止，已从博落回中鉴定和分离出147 种生物碱，从化学结构上看，它们大多属于异喹啉类生物碱[9]，是一种潜在的抗生素生长促进剂替代品[10]。博落回在北美、东亚和欧洲国家均有生长，北美主要分布于密西西比河以东的温带北部地区，中国主要分布于山西、贵州、云南、江苏和浙江等长江中下游地区[11]。几十年来，在许多国家，博落回提取物已被广泛用于饲养牲畜。在欧洲，博落回被欧洲食品安全局(EFSA)批准允许在动物生产[6]中作为饲料添加剂成分使用。在中国以血根碱和白屈菜红碱为主要成分的产品已经开发成国家二类新中兽药(2011 新兽药证字34 号)和药物饲料添加剂产品博落回散(兽药添字180415250)[12]。博落回作为重要的中草药资源，其合理开发利用对于未来养殖减抗、饲料无抗具有重要的研究和使用价值[13]。

关于博落回或其有效生物碱的体外抑菌试验已有文献报道，试验菌种有细菌也有真菌，有些是动物生产中常见菌种，也有些是农业生产中的常见菌种，但专门针对养猪生产中常见细菌的报道较少，并且博落回提取物针对这些菌种的时间—杀菌效果尚未见报道。本研究对养猪业常见的4 种细菌进行了体外抑菌试验，并研究博落回提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的时间—杀菌效果，以期为更全面了解博落回的抗菌活性提供试验数据，同时为其在动物生产中的添加使用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

博落回提取物(M.cordataextract，MCE)：由本实验团队提取，经高效液相色谱法(HPLC)测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45%和19%。

受试菌株：大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis，ATCC 13312)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 9027)均由昆明海关技术中心动物检疫实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化和菌悬液制备

将含有保存菌种的磁珠冻存管从-80 ℃冰箱中取出，挑1 粒磁珠放到含5 mL 营养肉汤培养基的细菌瓶中，放入控温摇床培养箱(S130H，英国Stuart 公司)中进行培养(250 r/min，37 ℃)。培养约6～8 h 后将细菌瓶拿出，采用麦氏比浊管法用无菌生理盐水将细菌培养物稀释到0.5 麦氏浊度，此时细菌密度约为1.0×108CFU/mL，按1∶100 稀释菌液至含菌量约为1.0×106CFU/mL，作为试验菌液。

1.2.2 抗菌活性测定

抗菌活性测定采用抑菌圈法，参照LEHRER 等[14]和马卫明[15]的具体方法进行。在无菌培养皿内倾倒15 mL 经高压灭菌后冷却至50 ℃的琼脂培养基与100 μL 菌液，快速混合均匀，待琼脂冷却凝固后，在琼脂板上用无菌打孔器打直径为6 mm 的圆孔，孔间距大于2.5 cm。在各孔中加入15 μL 不同质量浓度的MCE 或5 mg/mL 盐酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride，Solarbio 公司)，并设阴性对照孔。将培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱(ICP110，德国Memmert 公司)中培养18 h，各设3 个重复，用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值。抗菌活性用抑菌圈直径表示：抑菌圈直径=总直径-孔直径。

最小抑菌质量浓度(minimal inhibitory mass concentration，MIC)、最小杀菌质量浓度(minimal bactericidal mass concentration，MBC)的测定和时间—杀菌曲线的绘制参考韩菲菲[16]、傅瑞春[17]和郭春娜[18]的方法进行。

1.2.3 MIC 和MBC 测定

取无菌96 孔平底微量培养板，每排测定1 个菌种，每个菌种做3 个重复。于每排的第2～11 孔将初始质量浓度为4 096 μg/mL 的MCE溶液进行2 倍连续稀释，于第2～12 孔中加入菌悬液，使各细菌终密度约为5.0×105CFU/mL。第1 孔只加培养液，作阴性对照，第12 孔只加菌液和营养肉汤培养基，作测试组。将培养板置于37 ℃下保湿静置培养18～24 h；培养后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，菌液清澈透明的孔为无细菌生长，未出现浑浊的最低质量浓度记为最小抑菌质量浓度，即该样品的MIC。自没有细菌生长的孔中取10 μL 培养液涂布于琼脂平板上，每孔做3 个重复，待完全吸收后，37 ℃下培养18～24 h，仍无菌落形成的平板所对应的MCE 质量浓度记为最小杀菌质量浓度(MBC)。

1.2.4 MCE 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的时间—杀菌曲线绘制

本试验测定0、8、4、2、1×MIC 共5 个质量浓度下MCE 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的时间—杀菌曲线。每个菌种各取5 个1.5 mL 无菌离心管，各管加500 μL 菌液。第1 管不加MCE，在剩余4 个管中将16×MIC 的MCE 进行2 倍稀释，使1～5 号管中MCE 的终质量浓度分别为0、8、4、2、1×MIC。将离心管置于37 ℃下振荡培养，于0、1、2、3、6、12、24 h 自各管中分别取10 μL 菌悬液进行10 倍系列稀释5 次，每个稀释度取3×10 μL 菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板，待完全吸收后，37 ℃倒置培养；过夜培养后，取3 个重复总菌落数在20～300 个的稀释质量浓度进行菌落计数，求CFU 平均值，计算各时间点对应的每个离心管内的菌液质量浓度。原始菌液质量浓度=菌落个数×稀释度×10 CFU/mL。相同试验重复3 次。以作用时间点为横坐标，每毫升菌悬液中所含细菌数(CFU)的常用对数为纵坐标、用Graphpad Prism 8.0 软件绘制时间—杀菌曲线。

1.3 数据处理与统计分析

试验数据用Excel 2007 软件进行初步整理后，结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 19.0软件的one-way ANOVA 进行单因素方差分析，差异显著时用Duncan 法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 MCE 对4 种受试菌的体外抗菌效果

不同质量浓度的MCE 对4 种受试菌的抑制能力各不相同，同等质量浓度的MCE 对4 种受试菌的抑制能力由强到弱依次是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和铜绿假单胞菌(图1 和表1)，但本试验选用的3 种质量浓度的MCE 对铜绿假单胞菌未表现出抑制能力。对除铜绿假单胞菌外的3 种受试菌，随着MCE 质量浓度的升高，抑菌能力也相应增强，呈现出质量浓度依赖性，但3 种质量浓度的MCE 抑菌能力均低于5 mg/mL 金霉素。

图1 不同质量浓度MCE 对4 种受试菌的抑菌效果)Fig.1 Antibacterial effects of different mass concentrations of MCE on 4 kinds of tested bacteria

表1 不同质量浓度MCE 对4 种受试菌株抑菌效果比较Tab.1 Comparison of antibacterial effects of MCE at different mass concentrations on 4 tested bacterial species

2.2 MCE 对4 种受试菌MIC 和MBC 的影响

MCE 对不同受试菌的MIC 和MBC 有差异(表2)。其中，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC 和MBC 相同，分别为64 和128 μg/mL；对猪霍乱沙门氏菌的MIC 和MBC 分别为128和256 μg/mL；对铜绿假单胞菌的MIC 最高，为512 μg/mL，测定MBC 时发现质量浓度为1 024 μg/mL 的MCE 与其混合培养24 h 后仍不能将其杀灭。除铜绿假单胞菌外，其余3 种受试菌的MBC 均是其MIC 的2 倍。

表2 MCE 对4 种供试菌株的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)Tab.2 The minimum inhibitory mass concentration (MIC) and minimum bactericidal mass concentration (MBC) of MCE against 4 kinds of tested bacteria μg/mL

2.3 MCE 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的时间—杀菌曲线

本研究选取养猪场常见的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)各1 株作为受试菌研究MCE 体外时间杀菌效果。随着MCE 质量浓度的增加，杀菌时间相应缩短，杀菌速率均加快，杀菌曲线相互分离，不存在杀菌效果在某一质量浓度时饱和的现象，显示MCE 为质量浓度依赖的杀菌规律(图2)。0×MIC 组的细菌在0～6 h 菌落总数一直快速增加，在6 h 后菌落总数虽然仍旧上升但上升缓慢，菌落总数相对稳定。添加不同质量浓度MCE 组的细菌生长受到持续抑制，菌落总数随着时间延长而逐渐减少，其中8×MIC 组在培养2 h 后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无菌落形成，表现出很强的杀菌效果，而4×MIC 和2×MIC 组分别需要到12 和24 h 时2 种细菌才会无菌落形成，1×MIC组到24 h 时仍有少量菌落形成。

图2 MCE 对金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的时间—杀菌曲线)Fig.2 The time-killing effect curve of MCE against S.aureus (a) and E.coli (b)

3 讨论

肠道是营养物质消化、吸收和代谢的主要场所，是动物体最大的营养吸收器官。此外，肠道还具有屏障和免疫功能，能防止病原微生物的入侵，保护机体健康。肠道的健康水平关系动物整体健康和生产性能的发挥。肠道健康时微生物群和肠道处于共生平衡状态，动物的消化吸收、生长发育和机体免疫不受影响[19]。当这种平衡状态被打破时，肠道内环境易受大肠杆菌等病原微生物的侵袭，导致仔猪抵御病原微生物能力下降，造成营养物质消化吸收障碍，引起仔猪腹泻等肠道疾病的发生。抗生素被用于防控仔猪腹泻。抗生素的滥用加速了耐药菌株的产生，造成猪肉中抗生素的严重残留，引起生态环境的污染[20]。抗生素的滥用，抗生素残留、细菌耐药性和环境污染等问题已经引起全世界的高度重视，“无抗”已经成为未来饲料业发展的趋势。伴随着饲料行业“无抗”时代的来临，新型绿色抗生素替代品已成为当今饲料行业的研究热点。博落回作为全世界广泛使用的药用植物，被认为具有很好的抑菌效果[6-7,9]，在世界药学实践中既有使用地域的广度，又有使用历史的深度，MCE 在仔猪生产中具有“替抗”的潜力。

抗菌活性是博落回及其生物碱具有的众多活性之一，也是在动物生产中备受重视的活性之一。研究其抗菌效力，有助于在动物生产中的使用及添加。抑菌圈试验、MIC 与MBC 测定和时间—杀菌曲线常用来检验药物体外抗菌活性。其中，抑菌圈试验是一种定性或半定量的方法，MIC与MBC 是一种定量方法，在抗菌药物质量浓度低于MIC 时易诱导产生耐药突变菌株，从而导致细菌耐药发生[21]；时间—杀菌曲线用于检验药物随时间变化对菌株的杀灭效果。本研究采用3 种方法测定MCE 体外抑菌的效果、质量浓度和速率。MIC 和MBC 检测结果与抑菌圈试验结果总体趋势一致，即相同质量浓度的MCE 对这4 种受试菌的抑制能力由强到弱依次是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和铜绿假单胞菌。但本试验选用的3 种质量浓度MCE 的抑菌能力均低于5 mg/mL 金霉素。MCE 除了具有抑菌能力外，还具有炎性调节和免疫力调节等作用，因此，虽然在质量浓度接近的情况下，MCE抑菌能力不如专用抗生素效果好，但并不影响其作为饲料添加使用。KHIN 等[6]研究了博落回提取物、血根碱和白屈菜红碱对野生型、多重耐药金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果表明：3～10 μg/mL的血根碱和白屈菜红碱对金黄色葡萄球菌均有完全抑制作用，其抗菌活性与氯霉素相同或更强。赵东亮等[22]和王朝元等[23]研究均发现：博落回生物碱对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，赵东亮等[22]还发现：博落回生物碱对大肠杆菌无效果。胡贵丽等[24]研究发现：博落回血根碱对沙门氏菌高度敏感，对金黄色葡萄球菌中度敏感，对大肠杆菌低度敏感，其中，博落回血根碱对沙门氏菌的抑菌效果优于青霉素钠。这些研究与本试验的结果均有不同之处，可能是由于采用的试验材料、添加质量浓度、有效生物碱含量以及药物对照不同所致。KOSINA 等[25]用S.aureusCCM 3953、

S.aureusCCM 4223、P.aeruginosaCCM 3955、E.coli(CCM 4225 和CCM 3954)以及S.agalactiae作为受试菌研究了博落回不同部位提取物和其生物碱的抗菌活性，结果表明：对于大多数受试菌，博落回不同部位提取物随着血根碱(SG)和白屈菜红碱(CHE)质量浓度的升高，抗菌活性增强，但不同部位提取物的抗菌活性都低于血根碱和白屈菜红碱本身的抗菌活性。他们在研究中还发现：SG 和CHE 对P.aeruginosa的抗菌活性较弱。我们的试验结果与这一发现一致，在抑菌圈试验中所选的3 种质量浓度的MCE 均未对P.aeruginosa表现出抑制效果，而5 mg/mL 金霉素对P.aeruginosa有抑制活性，抑菌圈直径为9.38 mm，这也说明选用的3 种质量浓度的MCE对P.aeruginosa的抑菌效果不如5 mg/mL 金霉素。测定MBC 时发现：质量浓度为1 024 μg/mL的MCE 与P.aeruginosa共同培养24 h 后虽表现出一定的抑制效果，但仍不能将其完全杀灭。

相对于MIC 值和MBC 值而言，时间—杀菌曲线能更好地描述MCE 杀菌效果随时间的变化过程。通过测定不同质量浓度下MCE 对细菌的lg (CFU/mL) 随时间的变化，可以直观地反映MCE 的杀菌效果，更直观地描述MCE 的抗菌作用随时间和质量浓度变化的趋势，但此前关于MCE 或其有效生物碱的体外时间—杀菌曲线试验尚未见报道。为了研究MCE 体外杀菌速率，本研究挑选养猪场中常见的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为受试菌进行时间—杀菌曲线试验，在试验中MCE 选了5 个质量浓度(0×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC 和8×MIC)，设置了7 个时间点(0、1、2、3、6、12 和24 h)，试验结果发现：8×MIC 的MCE 杀菌速度最快，只需要2 h就能将2 种受试菌完全清除，4×MIC 的MCE 需要12 h 才能将细菌清除，2×MIC 的MCE 需要24 h后才检测不到菌落形成，而1×MIC 的MCE 杀菌速度最为缓慢，培养24 h 仍能检测到活菌生长，此时大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的质量浓度分别为1 430 和1 270 CFU/mL。本研究发现随着MCE 质量浓度增加，杀菌效果增强，符合质量浓度依赖的杀菌规律。

4 结论

MCE 对4 种革兰氏阳性和阴性受试菌均有一定的抑制作用，抑制能力由强到弱依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、铜绿假单胞菌，其中MCE 对铜绿假单胞菌抑制能力最弱，MBC ＞1 024 μg/mL；2、4、6 mg/mL 的MCE抑菌能力均低于5 mg/mL 金霉素；MCE 体外杀菌速率随质量浓度升高而增快，呈现浓度依赖性。