MicroRNA-150水平与原发性肝癌手术预后的关系*

吴娜娜，陈星宇，姚辉华，王忠福

（成都市第一人民医院1.肿瘤二科，2.胃肠疝外科，3.介入血管外科，四川成都610041）

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,PHC）恶性程度高，发病隐匿，大部分患者确诊时已处于中晚期，且有肝内外转移，即便接受肿瘤切除术，患者术后5年生存率仅有24%～50%[1-3]。目前临床针对PHC 高危人群的筛查主要依赖于超声检查及甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），但超声检查很难发现微小病灶，且PHC 患者中AFP 轻度升高或呈阴性占比高达20%～40%，存在一定的漏诊率[4-5]。因此，挖掘新的PHC 预后分子标志物，探讨新型防治靶点及侵袭转移分子机制，对延长患者生命具有指导性意见。PHC 的发生、发展属于一个多步骤、多阶段过程，每个阶段均有着不同的细胞信号传导通路异常、癌基因及抑癌基因失衡、细胞周期调节改变等，而miRNA 可作为抑癌基因或癌基因影响细胞凋亡、增殖、迁移等肿瘤相关通路，进而调控肿瘤诸多生物学行为[6-7]。miR-150 是定位于19q13.33的单链miRNA，长度为2 nt，近年来不断有研究发现，miR-150 在系统性硬化病、恶性肿瘤、组织纤维化、肺动脉高压等多种疾病中异常表达[8]。有研究发现，肝癌患者血清miR-150 水平下调，其水平与患者病理学特征密切相关，但尚不清楚miR-150与肝癌患者预后的关系[9]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2018年1月在成都市第一人民医院接受手术治疗的PHC 患者80 例作为PHC 组。其中，男性52 例，女性28 例；年龄45～79 岁，平均（63.02±5.11）岁；体重指数（body mass index, BMI）18.5～24.6 kg/m2，平均（21.59±2.24）kg/m2。纳入标准：①符合《原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）》[10]中PHC诊断标准；②Child-Pugh分级A级、B级；③检测前未接受放疗、化疗及射频消融等治疗；④首次接受肿瘤切除术，无手术禁忌证。排除标准：①活动性肝炎；②药物或酒精性肝损伤；③既往接受肝移植或肝胆手术；④肿瘤保留不完整、边界模糊；⑤凝血功能异常；⑤伴有自身免疫疾病、其他肿瘤或精神疾病。另选取同期本院健康体检者80 例作为对照组。其中，男性49例，女性31例；年龄42～80岁，平均（62.94±4.86）岁；BMI 18.95～25.2 kg/m2，平均（22.03±2.15）kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂

Trizol Reagent 试剂盒（德国凯杰公司），TapMan MicroRNA RT 试剂盒（美国ABI 公司），miR 特异性TapMan 探针及TapMan Universal PCR Master Mix（美国ABI 公司）。

1.3 方法

采集PHC 组术前、术后3 d 及对照组体检当日的5 ml 空腹静脉血，置于含有EDTA 抗凝试管中，室温下静置1 h，3 000 r/min 离心10 min，取上清液于干净离心管中，置入-80℃冰箱冷冻保存。使用Trizol Reagent 试剂盒提取血清中总RNA，通过TapMan MicroRNA RT 试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，具体操作参照说明书。使用miR 特异性TapMan 探针及TapMan Universal PCR Master Mix 进行miR-150 的qRT-PCR 检测，U6作为内参基因，其正向序列：5'-GGTATGATGCAGTAGCACC-3'，反向序列 ：5'-AAGTGATCGCAGTACGTAC-3'，长度分别为121 bp、119 bp；miR-150 正向序列：5'-GTGTATGCAGCAGT AGCTGGA-3'，反向序列：5'-CAGTAGTCAGTACGGA CGAAG-3'，长度分别为116 bp、118 bp。总反应体系为20 μl，qRT-PCR 反应条件：50℃预变性2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共循环40 次。根据2-ΔΔCt法计算miR-150 相对表达量。电话随访时间截止至2021年2月，统计PHC 患者术后1年和术后3年生存率。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，影响因素的分析用多因素Cox 风险比例模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者手术前后血清miR-150相对表达量比较

对照组、PHC组患者术前血清miR-150相对表达量分别为（0.93±0.15）和（0.42±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=26.077，P=0.000），PHC组较对照组低。PHC组术后血清miR-150相对表达量为（0.73±0.12），与术前miR-150相对表达量比较，差异有统计学意义（t=18.485，P=0.000），术后较术前高。

2.2 不同血清miR-150水平患者的临床病理特征比较

以miR-150 相对表达量0.42 作为分界值，将PHC组分为高表达组和低表达组，分别有48和32例。两组患者不同组织分化程度、不同TNM 分期、是否伴有肝硬化及是否伴有转移比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者性别比、不同年龄、不同肿瘤直径、是否伴有肝硬化复发、是否伴有乙型肝炎、不同AFP 水平、是否伴有门脉癌栓比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组患者临床病理特征比较 例

2.3 血清miR-150水平与PHC患者预后的关系

高表达组与低表达组患者3年累积生存率分别为62.50%和21.88%，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=15.946，P=0.000），低表达组较高表达组低。低表达组、高表达组中位生存时间分别为19.4 个月、29.0 个月。见图1。

图1 高表达组和低表达组患者的生存曲线

2.4 影响PHC患者3年生存率的Cox回归分析

单因素、多因素Cox 回归模型分析结果显示，miR-150 低表达、肿瘤直径≥5 cm、TNM 分期Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、转移、AFP ≥25 ng/ml 及伴有门脉癌栓是影响PHC 患者3年生存率的独立因素（P＜0.05）。见表2、3。

表2 影响PHC患者3年生存率的单因素Cox回归分析参数

表3 影响PHC患者3年生存率的多因素Cox回归分析参数

续表3

3 讨论

目前，临床关于PHC 的具体发病机制尚未完全阐明，但多认为与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、吸烟、环境污染等因素相关[11]。现代研究表明，肿瘤的发生、发展属于分子调控失控过程，涉及诸多环节，包括抑癌基因失活、癌基因激活、细胞基质间黏附障碍及细胞信号传导异常等[12]。但对PHC的病理、生理认知仍存在一定不足，深入分析其发病机制及防治靶点，尤其是借助测序技术、分子生物学等手段探索评估预后的新型标志物，对改善PHC 预后尤为重要。

miRNA 属于一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，由22 个核苷酸构成，长度18～25 nt，其与下游多个靶基因结合后可抑制、降解转录后基因水平，调节靶基因蛋白和mRNA 表达，进而调控细胞细胞分化、凋亡及增殖的诸多生物学特性，同时参与调控肿瘤干细胞、调节肿瘤微生物及肿瘤的迁移、侵袭等过程[13]。ZHANG 等[14]研究发现，miR-150 在结直肠癌组织中低表达，且可能通过抑制高迁移率族蛋白A2阻断细胞增殖，下调Cyclin A表达阻滞细胞周期。JIANG 等[15]研究报道，miR-150 在非小细胞肺癌细胞中显著上调，其可能通过SIRT2/JMJD2A 信号通路对细胞活力及迁移产生调节作用。乔恩奇等[16]研究发现，miR-150在乳腺癌中高表达，干扰miR-150表达可促进细胞凋亡及抑制细胞增殖，其作用机制可能与调控PI3K/Akt 信号、上调Leaved Caspase 等有关。以上研究证实，miR-150 在不同环境及疾病中可发挥一定的抑癌或促癌因子作用，但其在PHC 中是否发挥同样作用及具体的机制尚未完全阐明。ZHANG 等[17]研究发现，miR-150 在原发性肝细胞癌中呈低表达，且可能通过下调靶标c-Myb 参与肝脏干细胞自我更新。YU 等[18]研究报道，肝细胞癌患者血清miR-150水平比健康对照者低，术后miR-150水平升高，肿瘤复发后降低，诊断慢性乙型肝炎病毒感染相关肝细胞癌的AUC 为0.931，敏感性为82.5%，特异性为83.7%，Kaplan-Meier曲线分析显示，miR-150水平较低的患者总生存期更短。

本研究结果发现，miR-150 表达可能与PHC 患者组织分化程度、TNM 分期、是否伴有肝硬化及转移相关，提示miR-150 水平与PHC 患者发生、发展关系密切，miR-150高表达可能对抑制癌转移、减轻病情有一定作用。其原因可能在于miR-150过表达可能抑制癌细胞血管生成及转移能力，而下调miR-150表达可加速肿瘤细胞转移、侵袭，增强肿瘤血管生成能力，故miR-150 在PHC 患者中发挥抑癌作用。多因素Cox 回归模型分析发现，miR-150 低表达、肿瘤直径≥5 cm、TNM 分期为Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、转移、高AFP水平及伴有门脉癌栓是影响PHC患者3年生存率的独立因素。

综上所述，miR-150 在PHC 患者中低表达，与患者预后、组织分化程度、TNM 分期等关系密切，有望成为评估PHC 患者预后的新型分子标志物。但因本研究存在观察时间短、样本量少、样本来源单一等局限性，有待延长观察时间、扩大样本量及范围进一步探讨。