自制吹干装置在滤纸干血片样本制备中的应用

谌玉佳， 孙智勇， 王少静， 杨江涛， 吴本清

（1.暨南大学第一临床医学院，广东 广州 510632；2.深圳爱湾医学检验实验室，广东 深圳 518000；3.中国科学院大学深圳医院，广东 深圳 518000）

干血纸片法是目前新生儿遗传代谢病筛查的主要检测方法。据统计，目前我国每年制备的新生儿滤纸干血片超过1 500万张，但是由于人员、方法、条件限制等多种因素的影响，导致临床实际操作中滤纸干血片制备不合格率居高不下[1]。部分医疗机构由于缺乏相应的样本制备设备，不得不“就地取材，各显神通”地进行操作，样本污染、制备不符合要求的情况时有发生。2015年，全国224家新生儿筛查实验室中不合格滤纸干血片百分比的均值为0.57%[2]。有研究结果显示，滤纸干血片样本不合格的主要原因为未充分干燥、未充分渗透、无法洗脱及未干燥造成的污染等[3]。目前，各大医院普遍采用自然晾干方式对滤纸干血片进行干燥，耗时3～4 h，需由人工判断血片是否晾干，人为影响因素较大。此外，由于缺乏对温度和湿度的控制，当温度或湿度出现波动时，会严重影响滤纸干血片样本的质量，易导致样本制备失败和污染。在临床实验室目前所能使用的各类实验前处理设备中，水浴箱的湿度过大，不利于干燥；孵育箱或烤箱依靠温度烘干血斑，不是自然干燥，极易出现影响检测结果的情况；人工空气对流的方式能够提高干燥效果，但是由于空气的扰动极易出现血斑凝固不均匀，而且需要专人操作，费时、费力，且无法实现操作的标准化。为此，本研究聚焦此技术难点，研制出滤纸干血片的专用吹干装置（专利号：ZL201820117643.8），并对该装置的干燥条件和干燥效果（均一性、精密度、准确性）进行评价。

1 材料和方法

1.1 样本来源

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集健康成人自愿者静脉血10 mL，备用。取50 μL全血滴在滤纸片上（直径12 mm），制备滤纸干血片。

1.2 仪器与试剂

琥珀酰丙酮和非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒购自广州市丰华生物工程有限公司，检测仪器为API 3200三重四级杆串联质谱仪（美国 AB SCIEX公司）。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。干燥仪器为自制滤纸干血片吹干装置（简称吹干装置），见图1。

图1 吹干装置实物图

1.3 方法

1.3.1 干燥条件的筛选 实验组1：在室温（23±2）℃、湿度60%±5%的环境下，分别采用自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干装置干燥、放置10 min后用吹干装置干燥、放置20 min后用吹干装置干燥、放置30 min后用吹干装置干燥5种方式干燥血片。实验组2：在室温（23±2）℃、湿度80%±5%的环境下，分别采用自然晾干和即刻（放置0 min）用吹干装置干燥2种方式干燥血片。2组实验均以放进吹干装置的时间计为0 min，每隔5或10 min拍照1次，记录血片干燥状态随时间变化的情况。

1.3.2 滤纸干血片的色谱效应（均一性） 取50 μL全血滴在滤纸片上，分别采用自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干装置干燥、放置10 min后用吹干装置干燥、放置20 min后用吹干装置干燥4种方式干燥血片，制成滤纸干血片。用直径3 mm的打孔器从血片中心及周边部位（左上、右上、左下、右下）打孔，见图2。每种干燥方式制备6份样本，共制备120份滤纸干血片样本。根据2019年全国临床检验室间质量评价项目“新生儿遗传代谢病串联质谱筛查-氨基酸和酰基肉碱”的评价指标，采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）测定滤纸干血片样本中的8种氨基酸[瓜氨酸（citrulline，CIT）、亮氨酸（leucine，LEU）、甲硫氨酸（methionine，MET）、苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、缬氨酸（valine，VAL）、丙氨酸（alanine，ALA）、精氨酸（arginine，A R G）]和1 5 种酰基肉碱[游离肉碱（f r e e carnitine，C0）、乙酰肉碱（acetylcarnitine，C2）、丙酰肉碱（propionyl carnitine，C3）、3-羟基丁酰肉碱（3-hydroxybutyryl carnitine，C4-OH）、丁酰肉碱（butyryl carnitine，C4）、异戊酰肉碱（cisovalerylcarnitine，C5）、戊二酰肉碱（glutaryl carnitine，C5DC）、己酰肉碱（hexanoyl carnitine，C6）、辛酰肉碱（octanoyl carnitine，C8）、癸酰肉碱（decanoyl carnitine，C10）、月桂酰肉碱（lauroyl carnitine，C12）、十四烷酰肉碱（myristoyl carnitine，C14）、棕榈酰肉碱（palmitoyl carnitine，C16）、3-羟基棕榈烯酰肉碱（3-hydroxypalmitoyl carnitine，C16-OH）、十八碳酰肉碱（octadecanoyl carnitine，C18）]，考察不同吹干方式对滤纸干血片色谱效应的影响。如周边打孔取样的检测结果与中央打孔取样的检测结果的偏差在±15%范围内，说明滤纸干血片的色谱效应不明显；如吹干装置干燥的滤纸干血片与自然晾干的滤纸干血片的色谱效应都不明显，说明吹干装置干燥方式不会影响血液在滤纸片上的均匀分布。

图2 滤纸干血片打孔位置示意图

1.3.3 精密度和准确度 取50 μL全血滴在滤纸片上，分别采用自然晾干、放置10 min后用吹干装置干燥（约40 min后取出血片）、放置20 min后用吹干装置干燥（约40 min后取出血片）、放置30 min后用吹干装置干燥（约40 min后取出血片）6种干燥方式干燥血片、放置30 min后用吹干装置干燥（约50 min后取出血片）、放置30 min后用吹干装置干燥（约70 min后取出血片）。用直径3 mm的打孔器从滤纸干血片中心打孔，每种干燥方式制备6份样本，共制备36份滤纸干血片样本。采用LC-MS/MS检测8种氨基酸和15种酰基肉碱，计算不同干燥方式的精密度[以变异系数（coefficient of variation，CV）表示]。以自然晾干方式处理的滤纸干血片检测结果的均值作为靶值，计算用吹干装置干燥方式处理的滤纸干血片的检测结果与靶值的比值，以此作为准确度。参照临床检验定量测定项目的室内质量控制监测项目允许不精密度要求[4]，氨基酸项目的允许不精密度为±25%，肉碱项目的允许不精密度为±30%。将国家卫生健康委临床检验中心室间质评量评价的允许偏移范围（氨基酸项目为±25%、肉碱项目为±30%）作为准确度的评价标准。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示。

2 结果

2.1 干燥条件的确定

在室温（23±2）℃、湿度60%±5%的条件下，自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干装置干燥、放置10 min后用吹干装置干燥、放置20 min后用吹干装置干燥、放置30 min后用吹干装置干燥5种干燥方式使血片达到完全干燥的时间分别为95、40、50、50和60 min。结合实际情况，建议血片用吹干装置干燥前的放置时间控制在20 min以内。见表1和图3。

图3 室温（23±2）℃、湿度60%±5%环境下不同干燥方式血片干燥时间

表1 自然晾干和放置不同时间后用吹干装置干燥血片达到表面基本干燥和完全干燥的时间 min

在室温（23±2）℃、湿度80%±5%的环境下，自然晾干和吹干装置干燥的速度均明显降低，血片达到完全干燥的时间均为115 min。见图4。

图4 室温（23±2）℃、湿度80%±5%环境下不同干燥方式血片干燥时间

2.2 滤纸干血片的色谱效应

无论是自然晾干，还是用吹干装置干燥，周边打孔（左上、右上、左下、右下）与中央打孔取样的检测结果除自然干燥方式中C8的差异为-15.51%、C16-OH的差异为-19.23%、即刻用吹干装置干燥方式中C16-OH的差异为-16.67%外，其他项目的差异为-14.81%～14.61%，均在±15.00%内，说明滤纸干血片的色谱效应不明显。见图5。

图5 不同干燥方式处理滤纸干血片后周边打孔取样与中央打孔取样的偏差

2.3 精密度和准确度

不同干燥方式处理后滤纸干血片的氨基酸和肉碱的变异系数（CV）为2.85%～21.98%、准确度为97.08%～118.18%，均符合要求。见表2。

表2 不同干燥方式处理后滤纸干血片的精密度和准确度

续表2

3 讨论

滤纸干血片具有“安全、简单、稳定性好，样本易于储存”的特性[5]，目前已被广泛用于新生儿疾病筛查。此外，滤纸干血片还可用于人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒感染和药物滥用者的快速诊断，以及遗传性疾病、基因突变等检测。虽然滤纸干血片凭借其突出的优点被广泛用于多个领域，但仍然存在色谱效应、打孔位置、点血体积，以及血细胞比容（hematocrit，HCT）等问题，可能会影响某些待测物的检测结果[6-8]。

滤纸干血片样本的采集、保存及运送流程等都有严格要求[9]。样本采集后需对其进行干燥，通常推荐在室温通风条件下干燥2～3 h，具体干燥时间应根据滤纸类型、取样体积及实验室具体的干燥环境来决定[10]。方可欣等[11]探讨了滤纸干血片制备环境中显著影响实验结果的理化因素，提示冷风快速（6 min）吹干可作为滤纸干血片制备的备选方案，但是他们只简单比较了4个指标的检测结果，未进一步对干燥方式进行方法学验证。本研究采用自制的吹干装置，模拟自然晾干环境，通过加快空气对流速度的方式干燥滤纸干血片，结果显示，将制备好的血片立即放入吹干装置干燥，只需要40 min就可将血片完全干燥，说明该装置可有效地提高血片的干燥速率；但由于吹干装置未设置控湿系统，在湿度为80%左右的环境中，血片的干燥速率会受到限制。因此，吹干装置使用的环境湿度必须控制在适宜的范围内。

若将滤纸干血片用于临床检测，必须考察其均一性。LENK等[8]等通过一个模型描述了干燥过程中由于边缘水分蒸发速率比中心水分蒸发速率快而导致的斑点不均匀的现象，提示血片的干燥方式会对滤纸干血片的均匀性产生影响。因此，本研究通过比较血片不同部位样本检测结果的差异来评价血片的均一性。结果显示，无论是自然晾干，还是采用吹干装置干燥，不同位置样本氨基酸和酰基肉碱检测结果的偏差绝大部分在±15.00%范围内，说明使用吹干装置干燥不会造成血液样本在滤纸片上不均匀的分布。这与李启亮等[12]的研究结果一致，说明本研究采用自制的吹干装置干燥血滤纸片的方式是可行的。

本研究还对不同干燥方式处理后滤纸干血片中氨基酸和酰基肉碱测定的准确度和精密度进行了验证，结果显示，采用吹干装置干燥和自然晾干制备的滤纸干血片的检测结果一致，准确度和精密度均符合要求。利用吹干装置干燥时，干燥时间的长短对检测结果精密度和准确度的影响也较小。

综上所述，与自然晾干相比，自制吹干装置可有效提高血片的干燥效率，且能使其被充分、均匀地晾干。因此，自制吹干装置可用于滤纸干血片的制备，为后续新生儿疾病筛查项目的检测提供高质量的样本。