细菌对抗生素与重金属的联合抗性机制研究进展*

戎玲玲 王复标 吴礼贵 冯关萍 肖小雨 邹小明

(井冈山大学生命科学学院，江西 吉安 343009)

环境中的生物已经不可避免地面临着污染物的联合影响[1-2]。抗生素和重金属是两类典型的环境污染物。环境中的抗生素主要来源于医疗、农牧养殖及工业生产等；环境中的重金属主要来源于农牧养殖、工农业生产及矿山开采等。抗生素和重金属在环境中都具有持久性特征[3-4]，因此环境中的抗生素和重金属联合污染状况日益严峻[5]。

研究表明，当细菌受到抗生素或重金属胁迫时会诱导产生抗生素抗性基因(ARGs)或重金属抗性基因(HRGs)。KNAPP等[6]研究发现，农田土壤中铜污染可诱导细菌产生tetM、tetW、blaOXA、ermB、ermF、copA、pcoB等抗性基因；ALONSO等[7]临床研究分离到的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)中发现含有mphB、cadA等抗性基因及cadA的转录调控基因cadC。细菌中的ARGs和HRGs可通过水平转移、基因重组等方式进行传播、扩散[8]。因此，ARGs和HRGs已被普遍视为新型环境污染物，而且ARGs已被世界卫生组织(WHO)视为21 世纪威胁人类健康的最重大挑战之一[9]。

细菌中的可移动遗传元件(MGEs)是ARGs和HRGs进行水平转移的主要载体，能促进基因重组[10]，促使ARGs和HRGs在不断重组、水平转移过程中形成联合抗性[11]。ENNE等[12]研究发现，单独降低磺胺类抗生素含量并不能有效控制磺胺类ARGs的丰度，原因是磺胺类ARGs与汞抗性基因位于同一MGE上，存在协同抗性，磺胺类ARGs的丰度同时受汞含量的影响。此外，交叉抗性、协同调控抗性和生物被膜抗性也是抗生素和重金属的联合抗性机制[13]。因此，本研究在归纳总结细菌中ARGs和HRGs来源的基础上，综述了协同抗性、交叉抗性、协同调控抗性和生物被膜抗性4种联合抗性机制。

1 细菌中ARGs和HRGs的来源

具有联合抗性机制的细菌常称为多抗细菌，在环境中广泛分布，其携带的ARGs和HRGs可通过多抗细菌自身繁殖进行垂直传播，也可通过细菌间的转导、结合等途径水平转移。细菌的抗性可分为内在固有抗性和外源获得抗性。

1.1 内在固有抗性

细菌的内在固有抗性是指存在于细菌基因组上的抗性基因原型、准抗性基因或未表达的抗性基因产生的抗性[14-15]，是细菌与生俱来的，有种属特异性[16]。环境中的抗生素可以作为细菌种群间或种群内的信号分子，激活细菌的内在固有ARGs，使其产生抗性表达，这是ARGs潜在的产生源[17]。随着多种细菌基因组和环境宏基因组测序技术的发展，科学家发现环境中存在着大量潜在ARGs及与抗性基因水平转移相关的MGEs[18]。

同样，作为细菌生长所需的微量元素的重金属也会激活菌体内固有的HRGs，使其表现重金属耐受性[19]。在高浓度重金属环境下(如火山喷发口)生存的细菌，通常具有HRGs。PAL等[20]就在火山喷发口检测到细菌中含有HRGs。科学家通过分析多年冻土和深层地下水发现，古细菌中铜和汞的古老抗性基因保守DNA序列与现代铜和汞的抗性基因相似度在95%以上[21-22]。

1.2 外源获得抗性

外源获得抗性是指细菌通过基因变异、获取新的基因等途径而获得的抗性。外源ARGs和HRGs主要通过质粒、整合子和转座子等MGEs在细菌间进行转移，少部分以结合、转化或转导的方式完成转移[23]。获得新的抗性基因的细菌形成了变种，获得的新抗性又成为了该变种细菌的内在固有抗性。

多抗细菌最初是在人体内发现的，它们随粪便排出体外，进入环境，从而将携带的抗性基因通过水平转移传播到环境中的细菌里[24]。污水处理厂产生的污泥中含大量抗生素和重金属的抗性细菌，排放后，各类抗性基因就进入了环境中[25]。水产养殖场常有ARGs和HRGs检出，有研究发现四环素类的抗性基因tetE与铜的抗性基因cueR位于同一质粒上[26]。畜牧养殖业由于常用重金属作为添加剂或用抗生素防治畜牧病患，造成动物体内耐药细菌的产生，这些耐药细菌及其携带的ARGs和HRGs随排泄物进入环境[27]。在我国的养猪场附近土壤中，四环素类、磺胺类ARGs和铜HRGs检出率较高，施用猪粪的农田土壤相比未施用猪粪的农田土壤检出更高水平的ARGs和HRGs[28-29]。由此可见，细菌通过抗生素或重金属诱导获得ARGs和HRGs而具有外源获得抗性已是普遍存在的现象。

2 抗生素与重金属联合抗性机制

2.1 协同抗性机制

协同抗性机制一般是指细菌中的多种特定抗性基因空间上位于同一个MGEs上，如同一个质粒、转座子或整合子上[30]，通常涉及汞、铜、银、砷、镉等HRGs和磺胺类、四环素类、大环内酯类等ARGs[31]。

具有协同抗性机制的ARGs和HRGs除位于同一个MGEs外，也有在其他地方发现的。LIMA等[32]研究发现，在伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)中还在SGI11基因组岛上同样共存着ARGs(blaTEM-1、catA1、strA、strB、sul1、sul2、dfrA7)和HRGs(merE、merD、merA、merC、merP、merT、merR)。MGEs或基因组岛对ARGs和HRGs的水平转移起着重要作用，它们的归趋必将影响抗性基因的环境效应，但目前研究多聚焦于抗性基因种类和数量，对抗性基因的环境归趋研究还甚少。表1总结了一些常见细菌中具有协同抗性的ARGs和HRGs。

表1 常见细菌中具有协同抗性的ARGs和HRGs

2.2 交叉抗性机制

交叉抗性机制一般是指细菌中某一代谢系统对不同的污染物(抗生素或重金属)同时产生抗性的机制，即不同的污染物攻击同一靶点而启动细胞的共同通路，使之对不同污染物同时具有抗性，如外排泵系统(又称射流系统)[36]，其原理是降低细胞内污染物的浓度，减少累积[37]。外排泵是一种转运蛋白，可分为7个家族：(1)三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)超家族；(2)抗性结节分化(RND)超家族；(3)易化(MFS)超家族；(4)多药及毒性化合物外排(MATE)家族；(5)小多耐药抗性(SMR)家族；(6)蛋白细菌抗菌化合物外排(PACE)家族；(7)p-氨基苯甲酰-谷氨酸盐转运蛋白(AbgT)家族。除ABC超家族是一类直接利用ATP水解能的主动转运蛋白外，其他6个家族均是利用离子电化学膜梯度为能源的次级主动转运蛋白[38]，各类外排泵家族的蛋白结构特征及针对性底物见表2。

表2 各类外排泵家族的蛋白结构特征及针对性底物

目前，外排泵系统是抗生素和重金属交叉抗性机制的主要表现形式，研究发现的外排泵系统种类及蛋白数量也在不断增加，但外排泵系统之外的交叉抗性机制研究还非常有限。

2.3 协同调控抗性机制

协同调控抗性机制是指在某种抗生素或重金属协迫下，细菌通过一系列转录、翻译、应答等信号转导系统对外源刺激做出调控的抗性机制[75]。其中，由膜定位的感应激酶或组氨酸激酶(HK)和胞质中的反应调节子(RR)组成双组分调控系统(TCS)是细菌中存在最广泛的协同调控抗性机制[76]。

环境中抗生素或重金属污染都能触发细菌中的协同调控抗性机制，两者均不但可以增强细菌抗性，而且还可以使其ARGs和HRGs表达上调。在革兰氏阳性细菌中，万古霉素抗性由VanRS TCS调控，VanS感应激酶对胞外糖肽类抗生素做出应答，将磷酸基团传递给VanR调节蛋白，活化的VanR调节蛋白可以与DNA结合进而激活染色体上相应的vanH、vanA、vanX等抗性基因[77]。POOLE等[78]研究发现，锌可以激发铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的锌抗性，还可以提高菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性，究其原因是锌可以激活AmgRS TCS上调表达氨基糖苷类抗生素的mexXY外排泵操纵子。KREAMER等[79]研究发现，BqsRS TCS可以调控铜绿假单胞菌对铁和氨基糖苷类抗生素的抗性，BqsS感应激酶通过RExxE基序感知Fe2+浓度变化，将磷酸信号传递给BqsR调节蛋白，BqsR调节蛋白通过结合一连串DNA序列激活转录系统使相关ARGs和HRGs表达上调。除外源重金属或抗生素外，细菌胞内某些生长所需组分浓度升高也可能会激发TCS的调控作用。LIU等[80]研究发现，在嗜麦芽寡养单胞菌中，调控多黏菌素B、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素等氨基糖苷类ARGs的PhoPQ TCS受胞内高浓度Mg2+的影响，使SmeZ外排泵表达上调，与此同时，细菌对该SmeZ外排泵调控的重金属和抗生素抗性增加。具有同源性的TCS在接受相同重金属刺激时还会作出不同的反应。LIU等[81]研究发现，调控czcCBA外排泵的czcRSs TCS包含czcRS1和czcRS2，前者的转录受Cd2+的抑制，而后者的转录却被Cd2+促进。由此可见，细菌的协同调控抗性机制依赖于一系列复杂的信号转导和相关基因的转录、翻译等过程，是菌体内在固有抗性和外源获得抗性间转化的桥梁。

2.4 生物被膜抗性机制

生物被膜抗性机制是在一类包裹于细菌胞外的具有胶黏性的以多聚糖为主的多聚物基质(EPS)及其周边沉淀的有机物和无机物保护下，使细菌菌体更好地适应环境，从而增强对外源有毒物质的抵抗机制[82]，主要包括膜渗透屏障作用和细菌群体感应效应(QS)[83]。

重金属和抗生素可诱导某些致病细菌产生生物被膜，这是临床顽固性细菌不易治疗的主要原因之一，因此病原细菌生物被膜被认为是医学和健康领域的一大隐患。SAKIMURA等[84]研究发现，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)在与不锈钢(含有铬、镍重金属)接触后会形成生物被膜，使其对万古霉素形成抗性，且其抗性在生物被膜形成的4～8 h内达到最强。GAIDHANI等[85]研究发现，对4种抗生素(庆大霉素、妥布霉素、多黏菌素B、利福平)和2种重金属盐(AgNO3、HgCl2)敏感的溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus)，在诱导其形成生物被膜后，就对它们产生了抗性，且随生物被膜的增长，抗性越强。此外，细菌对抗生素和重金属的抗性还与其生物被膜形成的时期有关。HALL等[86]研究发现，铜绿假单胞菌由浮游细胞进入静止期时，其生物被膜中的ndvB基因受RpoS因子的调控上调表达，从而在增加细菌菌体膜密度的同时增强了其对外源有毒物质的抗性。不同来源的同种属病原细菌形成的生物被膜成分及抗性有很大差异。VITALE等[87]通过比较分析人源性和动物源性的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)发现，前者的生物被膜相关基因表达水平更高，对青霉素类抗生素抗性也更强，表明病原细菌生物被膜的产生已对人类临床疾病治疗造成了极大挑战。

2.5 4种抗性机制的比较

细菌中协同抗性、交叉抗性、协同调控抗性和生物被膜抗性4种抗生素与重金属联合抗性机制均能使细菌同时对某些抗生素和重金属产生抗性，但彼此间又有不同。协同抗性机制是在空间上将ARGs和HRGs耦合在同一个DNA位置上，当细菌受相应抗生素或重金属刺激时，ARGs和HRGs同时表达产生联合抗性。交叉抗性机制则是在生理水平上将细菌的抗生素和重金属抗性耦合，主要以ATP水解能或离子电化学膜梯度为动力将有毒物质排出体外，当抗生素和重金属同时作为底物时，二者外排的共同通路被启动而产生联合抗性。协同调控抗性机制涉及细菌胞内复杂的信号转导和相关基因的转录、翻译调控过程，从细菌整体上进行抗性协调。生物被膜抗性机制更注重对菌体自身的保护，生物被膜的形成可以对环境中有毒物质起屏障作用，使细菌菌体免受毒害。在实际中，细菌的这4种联合抗性机制是相互交联、相互融合的。

3 研究展望

目前，对4种抗生素与重金属联合抗性机制的研究还停留在分析抗性基因的种类、数量、传播速率和细菌群落结构的变化上，在以后的研究中还需加强以下方面：

(1) MGEs的归趋研究。许多抗性基因常与MGEs相关联，而MGEs又是抗性基因在菌落间传播、扩散的关键因子，它对环境和人类生活的潜在危害更大。因此，开展MGEs在不同环境中迁移规律及环境归趋研究，将为抗性基因的削减和环境生态健康的评估提供更有力的理论依据。

(2) 生物信息学的应用。环境中抗性基因无处不在，许多未知的抗性基因仍有待人们去探索发现。根据目前已有的抗性基因数据库，结合宏基因组测序技术，可以采用生物信息学分析法去发现并解析更多抗性基因或抗性机制。如交叉抗性机制涉及很多膜泵蛋白，可通过生物信息学分析DNA序列或氨基酸序列同源性，并验证功能，不断发现新的抗性蛋白及抗性机制，从而提高人类对致病细菌抗性上的认知，加速新型抗菌药物的研发进程。

(3) 数学模型的应用。自然环境污染状况日趋复杂，除抗生素、重金属的单一或联合污染外，其他影响因素如光照、氧气、温度、pH、溶解氧、氮磷含量、菌群结构等也对抗性或抗性基因的形成、传播起着重要作用。建立并应用数学模型研究环境中细菌在复杂的环境因子影响下，抗生素和重金属联合污染的抗性响应形式及其机制，可以将菌体所含MGEs的种类、拷贝数等参数化，从而更好地解释或推测联合抗性发生的原因。