2型糖尿病肾病患者血浆肠源性内毒素水平变化及其意义

杨帆，陈烨，邓梅，秦胜花，陆思颜，李金燕

桂林市人民医院内分泌科，广西桂林541000

糖尿病肾病是糖尿病的慢性并发症之一，是一种较为常见的疾病，也是导致终末期肾病的主要原因，发病机制目前仍然不清楚，严重影响糖尿病患者的生存质量［1］。糖尿病的高血糖状态是糖尿病肾病的始动因素，糖脂代谢紊乱及肾脏血流动力学异常是糖尿病肾病的两大病理生理基础［2］。糖尿病肾病的治疗主要包括血糖、血脂的控制以及肾脏血流动力学的改善，然而即使血糖、血脂、血压控制达标，仍不能完全阻止糖尿病肾病的发生发展，提示还有其他因素参与了糖尿病肾病的发展过程。近年来，研究者通过对肠道微生物与2型糖尿病的宏基因组关联分析，发现2型糖尿病患者的肠道微生物谱发生了改变，这导致了血浆LPS水平升高，并且激活炎症因子，诱导一系列炎症反应［3-4］。因此，LPS能否通过炎症途径影响糖尿病肾病的发生发展需要探讨。如果两者存在相关性，那么调节肠道菌群、降低血浆LPS水平，或者阻断LPS与免疫细胞表面受体的结合，极有可能可以早期干预糖尿病肾病的发生发展。本研究观察了2型糖尿病肾病血浆肠源性内毒素（LPS）水平变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1—12月桂林医学院附属医院收治的2型糖尿病患者108例，男60例，女48例；年龄（57.13±9.95）岁；病程6（2～10）年；BMI（23.96±2.83）kg/m2；有吸烟史60.8%，饮酒史53.5%。纳入标准：所有研究对象均符合由世界卫生组织（WHO，1999年）糖尿病专家委员会提出的2型糖尿病诊断标准。排除标准：①1型糖尿病、妊娠期间的糖尿病及特殊类型糖尿病；②合并糖尿病急性并发症，如糖尿病高渗高血糖综合征、糖尿病酮症酸中毒或并发各种感染、应激状态；③甲亢、Cushing综合征等内分泌疾病；④高血压病、心肺功能不全、肝胆系统疾病、血液系统疾病、风湿免疫疾病、恶性肿瘤；⑤合并原发性及其他继发性肾脏疾病，如诊断明确的肾小球肾炎、肾盂肾炎、IgA肾病、肾病综合征、高血压肾病等；⑥合并急性胃肠炎、慢性炎性肠病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎等；⑦出现活动性尿沉渣（红细胞、白细胞或细胞管型等）；⑧泌尿系超声发现尿路梗阻、肾盂肾炎、结石等；⑨采样前2周内服用抗生素或益生菌等微生物制剂。以尿微量白蛋白/肌酐（ACR）为标准，将患者分为糖尿病肾病（ACR>30μg/mg，34例）和糖尿病 组（ACR<30μg/mg，74例）。另选健康体检人群32例作对照（健康对照组），男16例，女16例；年龄（52.38±6.75）岁；BMI（23.20±1.88）kg/m2；有吸烟史（每天至少吸1支烟并持续6个月或以上）8例（25%），饮酒史（长期饮酒达6个月以上或近1周大量饮酒达500 mL以上）10例（31.2%）。纳入标准：①无糖尿病、高血压病、内分泌疾病、风湿免疫疾病、肾脏疾病、血脂异常、感染性疾病；②无急性胃肠炎、慢性炎性肠病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎等；③采样前2周内未服用抗生素或益生菌等微生物制剂。本研究已获得桂林医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者签署纸质知情同意书。

1.2 观察指标及观察方法 ①血浆LPS：所有研究对象空腹8 h，使用肝素作为抗凝剂的采血管采集静脉血2 mL，30 min以1 000×g速度离心15 min，用移液器吸出上层血浆，装于冻存管中，编号，将标本放于-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。使用人脂多糖/内毒素（LPS）ELISA检测试剂盒检测血浆LPS水平，试剂盒反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，使用Curve Expert软件绘制标准曲线，样品的OD值取两孔的平均值，根据样品的OD值，在标准曲线上查出相应的浓度。②研究对象均空腹8 h，采集空腹静脉血，比浊法检测血清FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Scr、Cys-C，离子交换高效液相色谱法检测全血HbA1C，免疫层析法检测血浆hs-CRP。采用中国eGFR课题协作组推出的公 式 计 算eGFR=169×（Scr/88.4）-0.608×Cys-c-0.63×（Age）-0.157×0.83（if female）。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。正态分布的计量资料以±s表示，两组比较选用T检验，多组比较选用方差分析；非正态分布的计量资料以M（QL~QU）表示，比较选用秩和检验。计数资料比较选用χ2检验。两个变量之间关系符合正态分布，用Pearson相关系数描述，不符合正态分布，用Spearman相关系数描述。使用二元Logistic回归进行糖尿病肾病的影响因素分析，首先采用单因素Logistic回归对变量进行初筛，再用多因素Logistic回归调整混杂因素的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血浆LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比较 血浆LPS及血清TC、HDL-C、LDL-C、hs-CRP水平和eGFR比较见表1。

2.2 各组血清FPG、TG及全血HbA1C水平比较 血清FPG、TG及全血HbA1C水平比较见表2。

表2 各组血清FPG、TG、HbA 1C水平比较［M（QL~QU）］

2.3 血浆LPS与年龄、性别、吸烟、饮酒、家族史、病 程、BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、HbA1C、eGFR、hs-CRP等研究指标的相关性 血浆LPS水平与年龄、病程、hs-CRP呈正相关（r=0.216、0.267、0.501，P均<0.05），与eGFR呈负相关（r=-0.318，P<0.05），与性别、吸烟、饮酒、BMI、FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、HbA1C均无相关性（P均>0.05）。

表1各组血浆LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比较（±s）

表1各组血浆LPS、hs-CRP及血清TC、HDL-C、LDL-C水平和eGFR比较（±s）

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，△P<0.05。

组别糖尿病肾病组糖尿病组健康对照组n 34 74 32 LPS（pg/ml）1.97±0.21*△1.75±0.21*1.62±0.18 hs-CRP（mg/L）5.39±1.75△2.06±1.18-TC（mmol/L）4.51±0.85 4.35±1.01 4.47±0.53 HDL-C（mmol/L）1.00±0.23*1.05±0.27*1.51±0.30 LDL-C（mmol/L）2.89±0.64 2.71±0.81 1.60±0.40 eGFR［mL/（min·1.73 m2）］77.50±39.69*△97.50±27.57*104.93±14.60

2.4 2型糖尿病肾病发病影响因素和危险因素 为了初步筛选2型糖尿病肾病的影响因素，将患者各指标分别带入二元Logistic回归进行单因素Logistic回归分析，结果显示病程、eGFR、hs-CRP、LPS与2型糖尿病肾病发病有关（P均<0.05）。将单因素分析有统计学差异的指标为自变量，使用多因素二元Logistic回归分析评价2型糖尿病肾病发病的危险因素，纳入的变量包括病程、eGFR、hs-CRP、LPS，结果显示LPS、hs-CRP是2型糖尿病肾病发病的危险因素（P均<0.05）。详见表3、4。

表3 2型糖尿病肾病发病单因素Logistic回归分析结果

表4 2型糖尿病肾病发病单因素Logistic回归分析结果

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病的慢性并发症之一，也是导致终末期肾脏病的主要原因之一。研究［5-8］表明，我国2型糖尿病患者患糖尿病肾病的比例为10%～40%。糖尿病导致的慢性肾脏病所占的比例也逐渐增高，严重影响患者的生存质量。以往我们对糖尿病肾病的治疗主要包括血糖、血脂的控制以及肾脏血流动力学的改善，然而即使患者的血糖、血脂、血压控制达标，仍不能完全阻止糖尿病肾病的发生发展，提示除了上述两点因素外，还有其他因素参与糖尿病肾病的发展过程。近年我们通过深入的研究，发现糖尿病肾病的发生、发展还与氧化应激、慢性炎症、肾单位细胞内信号通路的激活等因素相关［9-12］。目前研究表明，2型糖尿病患者的肠道菌群失调导致了血浆LPS水平升高，并且激活炎症因子，诱导一系列炎症反应［4］。因此，我们猜想血浆LPS是否可以介导肾脏的慢性炎症反应，促进糖尿病患者的肾脏病变？本研究通过分析2型糖尿病肾病患者血浆LPS水平变化，以探索早期干预糖尿病肾病的治疗靶点。

脂多糖，又称内毒素，是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，也是由微生物群释放的。脂多糖由脂质A（疏水区）和O抗原核心区（亲水区）组成，是一种两亲性分子。脂多糖影响促炎细胞因子的分泌，被认为是胰岛素抵抗的触发因素［13］。本研究显示，2型糖尿病患者血浆LPS水平较健康对照组高。分析原因，可能由于肠道菌群失调导致革兰氏阴性杆菌比例增多以及肠道通透性增加，增多的内毒素通过通透性增加的肠壁进入血液循环。升高的血浆LPS水平使得糖尿病患者体内的炎症反应可能更加严重，且可能与2型糖尿病的发生、发展相关。这与目前所认为的代谢性内毒素血症增加了2型糖尿病的患病风险的观点一致［14］。体外研究发现，LPS干预的2型糖尿病肾病患者的单核细胞TLR4、NF-κB P65蛋白表达和IL-6水平明显高于健康对照组［15］。TLR4的表达与糖尿病肾病密切相关，TLR4可以导致NF-κB的核转位及相应免疫细胞的激活而发生转录，释放促炎症细胞因子，导致细胞增殖和凋亡，加重糖尿病肾病的发展，而LPS在人体内可以与CD14结合，作为TLR4的配体［16］。由此可见，LPS可以加重糖尿病患者肾脏的炎症反应，促进浸润的炎症细胞释放炎症因子，导致肾损伤。本研究还显示，2型糖尿病肾病患者hs-CRP水平较2型糖尿病患者高。作为临床上常用的一种炎症标志物，hs-CRP的水平不仅可以独立预测糖尿病、代谢综合征的发病风险，且与2型糖尿病肾病的发生有关。本研究结果与已知研究结果基本一致。本文结果显示，2型糖尿病肾病患者血浆LPS水平高于2型糖尿病患者，而且与hs-CRP呈正相关，因此LPS也可能能够预测糖尿病肾病的发病风险。本文结果还表明，LPS还与年龄、病程呈正相关，可能是由于血浆LPS水平主要受肠道菌群的影响，而年龄大、病程长的患者体内有害菌比例更高导致。最后通过多因素二元Logistic回归分析，显示LPS、hs-CRP可能是2型糖尿病肾病的危险因素，提示导致糖尿病肾病患者产生慢性炎症反应的因素是多样性的，而LPS极有可能是主要因素之一。

总之，2型糖尿病肾病患者血浆LPS水平升高，其与糖尿病肾病的发生、发展相关，有可能为早期干预糖尿病肾病提供治疗靶点，调节肠道菌群、降低血浆LPS水平或者阻断LPS与免疫细胞表面受体的结合极有可能可以早期干预糖尿病肾病的发生发展，LPS有可能为早期干预糖尿病肾病提供治疗靶点。本研究仍存在有不足之处，血浆LPS水平与糖尿病肾病的相关性研究为病例对照研究，需要进一步进行前瞻性队列研究来进一步确认两者的因果关系。其次，2型糖尿病肾病的发生发展极其复杂，尤其是在人体内，它涉及多种危险因素和遗传背景，而这是一项涉及单一因素的临床研究，故存在一定的局限性。此外，如果条件允许，我们还需要进一步研究患者粪便中的的肠道菌群与LPS水平，与血浆LPS水平进行对比，以排除潜在感染因素对实验的影响。