响应面法优化复合酶提高上部烟叶可用性的研究

杨 波，沈 嘉，杨继福，舒俊生，张福建，王绍林，陈 军，马 松

（1. 安徽中烟工业有限责任公司，安徽 合肥 230088；2. 安徽省农业科学院烟草研究所，安徽 合肥 2300312；3. 华环国际烟草有限公司，安徽 滁州 233121）

烟叶可用性是评价烟叶原料在卷烟配方中是否好用的一种指标。我国大部分烟区上部烟叶可用性的现状既提高了卷烟制造成本，又限制了卷烟质量水平。近年来，围绕提高烟叶上部叶可用性的研究主要在烟草农业方面开展，从品种[1-2]、生态条件[3-6]、栽培技术[7-10]、成熟度[11-13]、烘烤调制[14-15]等方面进行了大量的研究，但上部烟叶普遍存在的结构致密、内在化学成分不协调、劲头大、刺激性强、工业可用性不高等问题尚未完全解决，伴随着我国卷烟结构持续提升，上部烟叶大量积压库存，如何从工业角度提高上部烟叶可用性已经成为缓解烟叶等级结构矛盾，降低工业库存的必由之路。

目前，运用生物技术提高烟叶可用性已成为研究热点。生物技术包括微生物技术和生物酶技术，微生物技术主要是在烟叶醇化过程中添加微生物提高烟草品质，但由于对微生物发酵的本质缺乏深入的基础研究，加之生产工艺的限制，微生物发酵技术应用于烟草的品质改良还处于试验研究阶段，与实际应用尚有距离。生物酶技术主要是在烟叶中添加外源酶降低烟草中纤维素、淀粉、果胶等成分含量，协调烟叶中各种成分，从而改善烟叶品质。目前，国内外针对生物酶开展了大量研究。BABLER S[16]研究发现在烟叶中施加蛋白酶能降解烟叶中的蛋白质并产生相当数量的氨基酸，烟叶的香气显著提高。姚光明[17]研究发现，中性蛋白酶对烟叶中蛋白质的降解作用最为明显，烟叶的燃吸质量得到明显改善，对杂气和苦辣味的消除效果尤为明显。王继莲等[18]用细菌酶制剂处理烟叶，蛋白酶降解18.64%，氨基酸增加12.72%，同时香气成分不同程度增加。李晓等[19]、闫克玉等[20]研究表明，淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和果胶酶对提升烟叶香气和甜度，改善余味，降低刺激性、枯焦气等方面效果显著。谢会雅等[21]、李小斌等[22]用复合酶液处理烟叶，发现其对降解烤烟蛋白质的效果优于α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等单一中性酶。石志发等[23]用功能潜香剂、风味蛋白酶、糖化酶组合处理上部烟叶效果明显，烟叶淀粉、蛋白质含量降低，总糖、还原糖含量上升，致香成分增加。杨庆等[24]将糖化酶、纤维素酶、过氧化氢酶、淀粉酶等多种酶液按一定比例复配，添加的烟叶醇化后，烟叶总糖、还原糖、总植物碱、总氮、淀粉和蛋白质含量降低，致香成分总量增加，感官评吸青杂气减弱，舒适性变好。许春平等[25]用复合酶处理低次烟叶，烟叶总糖含量增加57.23%，蛋白质和总氮含量降低，施木克值增加，杂环类化合物、酮类和酸类增加，烟碱含量降低，烟叶刺激性减少，烟香改善，余味增加。

综合来看，生物酶制剂可以改善烟叶品质，提高香气，减少杂气等不良气息，提高舒适性。生物酶制剂的使用无疑为工业企业提高上部烟叶可用性提供了一条切实可行的路径。笔者针对工业企业上部烟叶难使用的现状，以皖南B3F等级烟叶为研究原料，围绕上部烟叶普遍存在的质量缺陷，借鉴前人的研究成果，针对性的选择生物酶制剂，通过不同生物酶制剂的筛选和复合酶制剂的优化，为上部烟叶可用性的提高提供理论参考和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.2 酶使用烟碱脱氢酶、脂氧合酶、蛋白酶、酸性木聚糖酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶共5种不同酶制剂。

1.1.3 主要设备所用主要设备有KBF240恒温恒湿箱、PL203-C电子天平、空气压缩机、烧杯、移液枪、喷枪和托盘等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备（1）处理样：称取200 g片烟，均匀铺放在托盘中；用移液枪移取不同浓度的酶溶液（浓度详见表1～表5），按烟叶重量的3‰放于烧杯中，并用纯净水稀释20倍；用喷枪将稀释后的单酶均匀喷洒在烟片上；将处理后的烟片放入恒温恒湿箱（温度40℃，湿度65%）中7 d后取出，在室温条件下存放40 d进行感官质量评价[26]。（2）对照样（CK）：将酶液换成纯净水，其他步骤同上。

1.2.2 感官质量评价按照安徽中烟工业有限责任公司《烟叶感官质量评价办法》进行定量评价和定性描述。定量评价包括香气特征（香气质、香气量和杂气）、烟气特征（劲头、浓度和细腻程度）和口感特征（刺激性、干燥感、余味和甜度），均采用9分制。燃烧性、灰色均采用5分制。试验重点针对香气量、香气质、杂气和余味进行定量评价和定性描述。

1.2.3 数据处理与分析采用Excel和Design-Expert 10.0.1进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 单一酶提高上部烟叶可用性的效果

2.1.1 烟碱脱氢酶由表1可知，烟碱脱氢酶单一酶处理中，当添加浓度在1.0‰～1.2‰时，香气质感略有提升，香气量略有增加，余味变得纯净舒适；当添加浓度在1.2‰时，对皖南B3F的综合改善效果最好，特别是对辛辣刺激性有较明显的改善。

表1 烟碱脱氢酶对皖南B3F烟叶改善效果 （分）

2.1.2 脂氧合酶由表2可知，当脂氧合酶的添加浓度在0.12‰～0.14‰时，香气量略有增加，余味略显舒适。当添加浓度在0.14‰时，对皖南B3F的综合改善效果最好，对枯焦气和辛辣刺激性均有不同程度的改善。当添加浓度在0.16‰时，综合改善效果最差。

表2 脂氧合酶对皖南B3F烟叶改善效果 （分）

2.1.3 蛋白酶由表3可知，蛋白酶单一酶处理中，当添加浓度在1.0‰～1.2‰时，香气质感提升，杂气特别是枯焦气降低明显。当添加浓度在1.2‰时，对皖南B3F的综合改善效果最好，对枯焦气和辛辣刺激性均有不同程度的改善。

表3 蛋白酶对皖南B3F烟叶改善效果 （分）

2.1.4 酸性木聚糖酶由表4可知，酸性木聚糖酶单一酶处理中，当添加浓度在0.4‰～0.6‰时，香气质感提升明显，杂气特别是枯焦气降低明显。当添加浓度在0.6‰时，对皖南B3F的综合改善效果最好，对枯焦气有不同程度的改善。

在偶像粉丝圈（俗称饭圈）中的粉丝属性大致分为三类，分别是唯粉、CP粉和团粉。唯粉，指的是只喜欢团队中其中一位偶像的粉丝，可能对其他团队成员没有好恶感受，也可能带有强烈的厌恶情绪；CP粉源起于韩国娱乐圈，CP是英文单词couple的缩写，CP粉指的是同时喜欢的两个明星并把他们假想成情侣关系的粉丝，且偶像CP组合方式并不限制性别。团粉即整个偶像团队的粉丝，团队中的每一个人都是团粉追捧的对象，因而团粉不接受成员争端和组合解散。

表4 酸性木聚糖酶对皖南B3F烟叶改善效果 （分）

2.1.5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶由表5可知，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶单一酶处理中，当添加浓度在0.4‰～0.8‰时，香气量提升明显，余味变得纯净舒适。当添加浓度在0.4‰时，对皖南B3F的综合改善效果最好，对枯焦气、辛辣刺激性有不同程度的改善。

表5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶对皖南B3F烟叶改善效果 （分）

由单因素试验结果可以看出，对皖南B3F上部烟叶的枯焦气和辛辣刺激性改善明显的主要是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，3种酶的适宜浓度分别为0.8‰～1.2‰、0.4‰～0.8‰和0.1‰～0.14‰。

2.2 响应面试验因素水平和结果

为进一步研究变量之间交互作用的影响关系，使用响应面分析法优化最佳复合酶组合。每个单因素的初步研究是响应面优化的指导范围，基于Box-Benhnken采样原理，选择对感官质量得分有显著提高的3个因素：蛋白酶（A）、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶（B）、脂氧合酶（C）进行三因素三水平的响应面分析试验（表6和表7）。

表6 响应面试验因素水平和编码

表7 试验设计与结果

利用Design-Expert 10.0.1软件对实验数据进行分析，得到二次多项回归方程：得分=22.64+0.05×A+1.867 66×10-15×B-0.075×C-0.2×AB-0.05×AC+8.871 66×10-16×BC-0.72×A2-0.52×B2-0.72×C2（编码制）。

对方程进行回归分析可知（表8），F值可用来检验各变量对响应值影响的显著性的高低。F越大，则相应变量的显著程度越高。当模型显著性检验值P＜0.05，说明该模型具有统计学意义。从表8可以看出，对感官质量得分影响大小顺序为：C＞A＞B，即：脂氧合酶＞蛋白酶＞淀粉-1,4-葡萄糖苷酶。模型的决定系数R2为0.994 2，说明模型具有高的显著性，而R2adj=0.986 8，能够解释实验98.68%的响应值变异，且与预测相关系数R2Pred也接近，说明此响应模型具有较高拟合精度，与真实数据拟合程度良好，具有实践指导意义，由此可以用该模型分析和预测改善效果最明显的复合酶制剂。

表8 响应面拟合回归方程的方差分析

响应面是响应值对各因素所构成的三维空间曲面图，可直观反映各因素及因素交互作用对结果的影响。不同酶的复配组合对感官质量得分的影响见图1～图3。从图1中可以看出，蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用对得分的影响呈抛物面分布，当蛋白酶一定时，随着淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的增加，得分呈现先上升后下降的趋势。同理，当淀粉-1,4-葡萄糖苷酶不变时，随着蛋白酶的提高，得分也呈现先增加后减小趋势。在二者交互作用下，蛋白酶引起曲面更大幅度波动，对得分影响更大。仅考虑二者因素作用下的最优组合范围为：蛋白酶为0.95‰～1.05‰，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶为0.7‰～0.9‰水平范围内。图2所示的交互响应面中，蛋白酶和脂氧合酶的变化均引起得分先增后减波动。相较于图1，二者整体波动幅度相对较大，说明蛋白酶与脂氧合酶交互作用对得分的影响要大于蛋白酶与淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互影响。当蛋白酶取1.0‰水平、脂氧合酶C取0.12‰水平附近的值时，该组合作用下的得分最高。由图3，交互曲面整体也呈一抛物曲面，可以看出，当淀粉-1,4-葡萄糖苷酶不变时，脂氧合酶引起曲面幅度变化更大，换言之，在交互作用中脂氧合酶的贡献率更大，实际酶的复合过程控制中应重点关注该影响较大的因素，设置合理的酶的复配方式。当设定淀粉-1,4-葡萄糖苷酶在0.7‰～0.9‰，脂氧合酶在0.115‰～0.125‰时，得分最高，应控制该条件从而得到最佳复配组合。

图1 蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用对感官得分的影响

图3 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶的交互作用对感官得分的影响

为进一步精准确定全局最优解，以得分最高为优化目标，根据分析结果，得分在蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、脂氧合酶的共同影响下的最优酶的组合为蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此条件下模型预测的最大得分为22.64分。在最优酶的组合下，皖南上部烟叶香气质提升明显，刺激性降低，劲头降低，杂气减轻，烟气明显柔和细腻，质量有明显提高。

3 讨 论

从研究结果来看，生物酶能够改善烟叶感官质量，增加烟草香味物质，减轻杂气和刺激性，生物酶的主要作用体现在生物酶能够促进烟叶中纤维素、果胶、淀粉等的生物转化，协调烟草中化学成分，降解烟草中的有害成分并提高烟叶香气成分。

单因素试验结果表明，蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶这3种单一酶对上部烟叶改善效果较好，这与前人研究结果[16-21]一致。3种单一酶的作用机理不同，蛋白酶主要将烟叶中蛋白质长的肽键分解成短肽；淀粉-1,4-葡萄糖苷酶作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，将淀粉分子分解成成葡萄糖；而脂氧合酶既与类胡萝卜素、绿素降解有关，又能催化亚油酸、亚麻酸氧化，形成正己醇、己烯酸、己烯醛等香气成分。

在单一酶试验研究基础上，项目组采用响应面分析法开展合理的试验设计进行试验，开展不同单一酶复配组合研究，利用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过响应面及软件运行计算得到最佳组合。在多种酶共同作用下，烟叶中的多肽、蛋白质、粗纤维以及淀粉类大分子有很好的降解转化作用，这有利于提高烟叶的内在化学成分协调性，从而使烟叶感官质量评分提高，对于提高上部烟叶可用性具体重要意义。

4 结 论

研究结果表明，添加生物酶可以提高上部烟叶质量，对皖南上部烟叶感官质量提升较大的是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，这3种酶对烟叶枯焦气、辛辣刺激性均有不同程度的改善。

在单因素试验的基础上，采用响应面法优化确定了最佳复合酶组合，最优组合为蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此条件下感官质量最优得分为22.64分。优化后的复合酶对皖南上部烟叶香气质提升明显，刺激性降低，劲头降低，杂气减轻，烟气明显柔和细腻，质量有明显提高。上述研究成果对于上部烟叶可用性提升有重要意义。