龙牙百合灰霉病病原菌灰葡萄孢菌的分离与鉴定

吴力红，李润根，廖振军，易 敏

（1. 株洲市渌口区农业农村局，湖南 株洲 412100；2. 宜春学院生命科学与资源环境学院，江西省作物生长发育调控重点实验室，江西 宜春 336000）

龙牙百合（Lilium brownii var.viridulumBaker）是百合科百合属多年生球根类草本植物。龙牙百合因其很高的药用、食用和观赏价值深受市场欢迎，也由此成为具备药、食、园艺观赏综合功能的重要经济作物，其种植产业逐步成为全国多个地区的重要经济支柱[1]。全国范围内，江西万载、泰和、高安，湖南隆回、安化、龙山，以及广西永福、资源、柳州等市县大面积推广龙牙百合的栽培[2]，使龙牙百合成为我国三大食用百合之首[3]。在江西万载，有近500 a种植历史的龙牙百合逐步发展成当地重要的特色经济作物[4]。随着栽培年限的延长与栽培面积的不断扩大，多个地区百合病害频发，病情也愈趋严重。其中，百合灰霉病的发生与危害尤为突出，重灾区可导致产量损失接近 40%[5]，市场上迫切需要针对百合灰霉病的有效防控策略。作为百合地上部危害最严重的病害之一，灰霉病的蔓延危害主要发生于每年4—6月间。田间发病症状为叶片枯死，花器褐腐，茎杆发黑。病害后期染病植株呈火烧状，病株地下鳞茎提早停止生长。灰霉病为害地区百合产量骤降，产品品质低劣，市场价值大打折扣。由此造成种植农户严重的经济损失，影响农户的种植积极性，最终制约该地区百合种植业的发展[6]。明确百合灰霉病的病原物是制定有效的防控策略、开展抗病品种选育、实施田间防治措施的必要前提，鉴于此，笔者针对江西万载百合灰霉病危害现状，开展病原物的分离、鉴定工作，研究结果将明确该地区的百合灰霉病病原菌，进一步研究致病菌的生物学特性与防治策略提供理论基础。。

1 材料与方法

1.1 材 料

龙牙百合灰霉病发病叶片于2017年4月6日采自江西省万载县高城镇百合生产基地。

1.2 病原菌的分离与鉴定

1.2.1 病原菌的分离纯化利用田间龙牙百合灰霉病发病叶片，采用常规组织分离法分离获得病原菌[7]。将分离后的菌株在20 ℃、黑暗条件下培养5 d，挑取尖端菌丝，培养至产生分生孢子，进行单孢纯化。纯化后的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基上预培养5 d后于4 ℃下保藏。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定将纯化菌株置于PDA平板培养基上，20℃黑暗条件下培养10～30 d进行活化[8]，并观察菌落和菌丝形态与着生情况。用10 mL/皿的无菌水配制孢子悬浮液，加入到100 mL 1%经灭菌的蔗糖水溶液中，置于25℃、180 r/min 的摇床振荡培养。培养8 h后显微镜下观测孢子萌发形态[9]。病原菌产孢梗形态与孢子着生方式参照郭润婷[10]方法。用灭菌的脱脂棉与石英砂在20℃黑暗条件下保湿培养菌株150 d后，观察菌核萌发情况。依据以上观测结果，参照《真菌鉴定手册》[11]对获得的病原菌进行初步分类鉴定。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定利用植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]对菌株的DNA进行提取。以菌株的DNA为模板，采用真菌ITS、G3PDH和HSP60基因序列的通用引物（表1）对相应基因序列片段进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系（25 μL）为：DNA模板2 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、Taq polymerase（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/μL）各1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，ddH2O 17.9 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，35个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行扩增子测序。将所得序列提交至NCBI/GenBank并获得基因登录号。同时，用所得序列在NCBI中进行序列比对，在比对结果中挑选代表性序列进行系统发育树构建[12-13]，根据目标菌株的序列在系统发育树中的分布，进一步推断菌株的分类地位。

表1 PCR扩增和测序用引物

1.3 Koch’s法则鉴定致病性

依据Koch’s法则对分离的病原菌进行致病性测定。采用健康的当年生百合叶片进行表面消毒后，将直接为5 mm的病原菌菌饼接种到用叶片上。接种后的叶片用无菌脱脂棉进行恒温保湿培养，培养温度为20℃，相对湿度为80%～90%。以无菌PDA培养基饼块作为空白对照，所有处理重复3次。培养3～5 d后观察发病情况。同时，选取具备灰霉病发病症状叶片再次进行病原菌的分离鉴定，以鉴定结果符合第一次分离鉴定结果为标准，即完成致病性测定。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 病原菌形态学鉴定将分离获得的菌株命名为YJ-3。将病原菌在PDA培养基上20℃培养24 h后，灰白色簇状菌丝长出，并向四周辐射状延伸。菌落呈不规则圆形（图1A和B），7 d后长满9 cm培养皿。进一步培养发现菌落逐渐转为灰褐色。显微镜下取样观测发现，病原菌分生孢子单生并着生于分生孢子梗末端膨大的体表面。孢子外观呈葡萄串状，大小为11.15（8.57～15.24）μm×8.12（5.71～10.48）μm（图1C）。分生孢子与分生孢子梗均为灰褐色。分生孢子在糖水中易萌发，从一端或两端长出芽管，培养8 h后可伸长至50～60 μm（图1D）。菌丝有隔，呈现不规则分支状，分支处有隘缩（图1E）。分生孢子梗散生不集结为孢子束或分生孢子座。孢子梗分支末端膨大，弯曲（图1F～H）。长满菌丝的菌板继续培养多天后，板外围散生大量黑色菌核。菌核形状不规则形或球形，嵌入培养基中或深埋在培养皿的底部（图1I）。菌核大小不一，在（1～3）mm×（2～4）mm。脱脂棉或石英砂保湿，20℃黑暗条件下培养150 d后，菌核萌发。萌发率分别为69.2%和88.9%（图1J）。依据以上结果，形态学初步鉴定该病原菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

图1 YJ-3致病性及其的形态特征

2.1.2 病原菌的分子鉴定将菌株的ITS、G3PDH和HSP60序列分别在NCBI序列库中进行搜索匹配。上述序列分别与MK562062.1、MH479930.1和MH479931.1相似度达100%。分析结果显示研究中的扩展序列与灰葡萄孢菌中的相应同源序列高度相似。选用近源种序列构建系统发育树（图2）结果表明，分离菌株的ITS、G3PDH和HSP60序列基因与灰葡萄孢菌中的相应基因序列高度同源。结合形态学鉴定结果，该病原菌鉴定为灰葡萄孢菌B. cinerea。

图2 基于G3PDH-HSP60基因整合序列采用邻接法构建的Botrytis属系统发育树

2.3 病原菌致病性鉴定

将龙牙百合叶片接种分离菌株，2 d后叶片可见病斑，3 d后叶片开始呈水浸状腐烂，并密生白色絮状菌丝，5 d后病斑扩大且密生白色絮状菌丝（图1K）。对照组无发病症状呈现（图1L）。随着接菌时间的延长，叶尖呈深褐色坏死、干枯，并不断扩展蔓延。从发病叶片上分离的菌株在PDA培养基上的培养特性与纯化菌株一致。分离物形态特征与原接种菌株一致。在无菌PDA培养基块的叶片中没有分离到相关致病菌。上述结果进一步表明研究中分离的病原菌菌株为百合灰霉病致病菌。

3 小结与讨论

通过形态学结合多基因分子生物学鉴定，明确了引起江西万载龙牙百合灰霉病菌的病原菌为灰葡萄孢菌。该结果首次揭示了灰葡萄孢菌在龙牙百合上致病，与引起江西、江苏南京、甘肃兰州、广西永福、广东广州和台湾地区的百合致病菌椭圆葡萄孢B. elliptica（Berk.）Cooke[6,14-17]和天竺葵葡萄孢B. pelargonii[8]不同。该研究结果与CAO X等[18-19]和杜艳丽等[20]鉴定的铁炮百合、兰州百合和东方百合灰霉病病原菌相同。

灰葡萄孢是一种常见的植物致病病原菌，也是已知的葡萄孢属中寄主范围最广的种， 可以侵染200种以上植物[12]。这种广谱寄生特性使得该病原菌的清除困难，防治效果不理想。研究基于其形态和分子特征，对万载龙牙百合灰霉病病原菌进行了鉴定，明确了致病菌的分类归属。该结果为针对性制定万载龙牙百合灰霉病的科学合理预防措施提供了重要依据。此外，江西龙牙百合种植区灰霉病发生时多伴有叶尖干枯病和黑斑病等病害的发生，栽培过程中应结合必要的综合防控措施。