高效液相色谱法测定苏打水中安赛蜜含量的不确定度评价

李 璐 张 哲 边 广 刘 冰

(泰安市疾病预防控制中心， 泰安 271000)

1 前言

为了提高测量结果表达的准确性和评定结果质量，本文依据GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》，采用高效液相色谱法测定了苏打水中安赛蜜的含量，并根据JJF1059.1-2012 《测量不确定度评定与表示》对其含量的不确定度进行了分析。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

苏打水 市售；苯甲酸溶液标准物质(1000 μg/mL)， GBW(E) 100167 1805；甲醇(CH3OH)， 色谱纯；硫酸铵((NH4)2SO4)优级纯；硫酸 (H2SO4)分析纯；乙腈(CH3CN)色谱纯；超纯水(Ω=18.2) 。

2.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪(Ultimate 3000)；电子天平(ALC-210.4)；超声清洗仪(KQ3200DE)；超纯水机(CASCADA I)；微孔滤膜(QYGL-002)。

2.3 实验方法

2.3.1样品处理

按照GB/T 5009.140-2003 《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》对样品进行处理。准确称取约2 g(精确到0. 001 g)试样于50 mL容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀后将试样放入超声清洗仪中超声脱气。取适量溶液通过0. 45 μm滤膜，滤液作HPLC分析测定用。

2.3.2标准溶液配制

准确吸取安赛蜜溶液标准物质2.00 mL于50 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制浓度为40.0 μg/mL安赛蜜标准中间溶液。分别准确吸取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL苯甲酸标准中间溶液，用超纯水定容至10 mL，配制成浓度分别为4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、12.0 μg/mL、16.0 μg/mL、20.0 μg/mL的标准系列工作溶液。

2.3.3色谱条件

色谱柱：Acclaim®120 C18柱(柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm)，柱温：25℃；流动相：0.02 mol/L硫酸铵溶液(800 mL)+甲醇(150 mL)+乙腈(50 mL)+10%硫酸溶液(1 mL)；流速：1.0 mL/min；紫外检测器，检测波长：214 nm；进样量：10μL。

3 不确定度来源分析

依据标准GB/T 5009.140-2003 《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》，样品中安赛蜜含量的计算公式为：

其中x为样品中安赛蜜含量(mg/kg)；ρ为由标准曲线得出的样品溶液中安赛蜜的浓度(μg/mL)；V为样品定容体积(mL)；m为样品质量(g)。

从样品质量、样品溶液体积和样品溶液浓度3个方面，分析测定安赛蜜含量的不确定度来源主要有样品称量、样品溶液配制、标准溶液配制、仪器的响应值和加标回收率等方面[6-10]。

4 不确定度分量的评定

4.1 样品称量引起的相对标准不确定度urel(m)

用德国Acculab ALC-210.4电子天平准确称取约2 g样品，精确到0. 001 g，根据电子天平校准证书的信息，Urel=0.0003g(k=2)，由此可计算样品称量引起的相对标准不确定度为：

4.2 样品溶液定容过程中引起的相对标准不确定度urel(V)

将准确称取的样品转移至50 mL容量瓶中，加入超纯水至刻度。此过程中使用的玻璃器具和温度均会引起测量结果的不确定度。

4.2.1样品溶液定容过程中玻璃量具引起的相对标准不确定度urel(V1)

4.2.2样品溶液定容过程中温度引起的相对标准不确定度urel(T1)

实验过程中所用玻璃量具是在20℃时校准，实验室温度则一般在20±5℃，由于玻璃量具受温度的影响很小，因此可以忽略不计。

本实验中所用溶剂为超纯水，水的膨胀系数为a=2.08×10-4/℃，因此样品溶液配制过程中温度引起的相对标准不确定度为：

由上述可以计算样品溶液定容过程中引起的相对标准不确定度:

4.3 标准溶液配制引起的相对标准不确定度urel(C)

4.3.1标准物质引起的相对标准不确定度urel(std)

安赛蜜溶液标准物质证书显示，其标准值为1000 μg/mL，扩展不确定度为2%(k=2)。则标准物质引起的相对标准不确定度为：

4.3.2标准溶液配制过程中玻璃量具引起的相对标准不确定度urel(V2)

表1 标准溶液配制过程中玻璃量具引入的不确定度

标准溶液配置过程中玻璃量具引入的合成相对标准不确定度为：

4.3.3标准溶液配制过程中温度引起的相对标准不确定度urel(T2)

忽略温度对玻璃量具的影响只考虑温度对溶剂的影响。实验中的溶剂是超纯水(a=2.08×10-4/℃)，则标准溶液配制过程中温度引起的相对标准不确定度为：

=0.147%

由上述可以计算标准溶液配制过程中引起的相对标准不确定度:

4. 4 标准校准曲线拟合引起的相对标准不确定度urel(q)

将标准系列工作溶液重复测定3次，测定所得到的峰面积以及拟合标准溶液浓度-峰面积曲线如表2所示。

表2 标准系列工作溶液测定结果

测量所得峰面积的标准偏差为：

=0.0861

在样品的实际检测过程中，重复测量样品2次(p=2)，两次测得峰面积分别为5.0803和5.1302mAU*min，应用曲线方程Y=-0.1309+0.4839X，计算得样品中安赛蜜的浓度分别为10.769和10.872 μg/mL，其平均值为10.820 μg/mL。由此校准曲线拟合引起的相对标准不确定度为：

式中，C0为样品中安赛蜜的实际测量浓度(μg/mL)；为标准系列溶液浓度的平均值(μg/mL)；b为拟合工作曲线的斜率；Ci为标准溶液浓度(μg/mL)；n为总进样次数。

由上述计算过程可以看出，校准曲线拟合的标准不确定度包含了标准溶液重复测量产生的不确定度、仪器自身数据处理系统引入的不确定度和标准溶液进样量的不确定度。

4.5 样品溶液重复测量引起的相对标准不确定度u rel(x)

样品溶液重复测量的不确定度主要是由样品的均匀性和仪器本身性能因素引起的，属于不确定度的A类评定。将同一样品溶液重复测定9次，测定的峰面积如表3所示。

表3 样品溶液重复测量结果

由表3中数据可得峰面积的平均值为5.1054 mAU*min，根据JJF1059.1-2012 《测量不确定度评定与表示》中标准不确定度的A类评定方法，采用贝塞尔公式计算峰面积单个测量值的实验标准偏差为：

由此可计算样品重复测量引起的相对标准不确定度为：

4.6 回收率校正因子引起的相对标准不确定度urel(frec)

在实验过程中，由于人员操作、所用器具和设备等原因，样品处理后安赛蜜含量会有所改变，实验采用对不含安赛蜜的样品中加入高、中、低3个浓度水平的安赛蜜标准物质进行检测，测定结果和回收率计算结果如表4。

回收率的标准偏差为：

回收率因子引起的相对标准不确定度为：

表4 加标回收率测定结果

5 相对标准不确定度的合成及扩展

5.1 合成相对标准不确定度

用高效液相色谱法测定白醋中苯甲酸含量时，可引起不确定度的因素及其对应的不确定度分量汇总如表5，由此可得苯甲酸含量的合成相对标准不确定度为：

表5 各分量相对标准不确定度汇总表

5.2 扩展不确定的评定和检测结果表示

取置信区间p=95%，k=2，则苏打水中安赛蜜测定的相对扩展U=k×ucrel(X)=0.0400

本文中测得样品中安赛蜜最佳估计浓度为270 mg/kg，因此其扩展不确定度为，样品中安赛蜜的测定结果为X=270±11 mg/kg，(k=2)。

6 结论

用高效液相色谱法测定苏打水中安赛蜜的含量，从样品质量、样品溶液体积和样品溶液浓度3个方面分别分析了影响测量结果不确定度的来源，主要有样品称量、样品溶液定容、标准溶液配制、标准校准曲线拟合、样品重复测量以及回收率校正因子，并分别对其进行量化和合成，；最终计算出安赛蜜测量结果相对标准不确定度为2.00%，扩展不确定度为11 mg/kg，因此本实验用高效液相色谱法测定苏打水中安赛蜜的含量为270±11 mg/kg (k=2)。影响检测结果不确定度的主要因素是标准物质、玻璃量具、 标准校准曲线拟合、重复测量和回收率校正因子。因此在实际测量过程中，应该选用准确度高的标准物质和玻璃量具，增加标准系列工作溶液的测量次数以及规范实验操作步骤等方式提高测量结果的准确性。