浙江与广西产三叶青水煎液体内肺癌抑制作用的对比研究

李礼斌，魏旻俊，李洪玉，余 平

(浙江省立同德医院·浙江 杭州 310012)

我国幅员辽阔、自然环境复杂、条件优越，分布着极其丰富的中药材资源，而中药材往往会因为地域、气候、水质及栽培方式等差异，药效有所不同，对于疾病的治疗效果存在差异[1-2]。野生中药材资源的锐减促进了中药材人工种植业的快速发展，然而只有在道地产区种植的中药材，药用活性成分含量才较高，药用效果好[3]。

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDielset Gilg)，又名石猴子、金丝吊葫芦、雷胆子等，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰等功效，常用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎、风湿、瘰疬、痈疔疮疖、月经不调等；随着其良好抗肿瘤效果的发现，三叶青被广泛地应用于各种肿瘤的临床治疗，同时，体内外肿瘤抑制实验研究发现其对于各种肿瘤细胞或组织具有良好的抑制效果[4-5]。三叶青主要分布于我国长江以南地区，如浙江、江西、福建、广西、湖南、湖北及云南等省份[6]。同样，受产地、种质、气候及种植条件等因素影响，三叶青在植物学特征特性、地下块茎产量以及有效活性成分含量存在显著差异[7-8]。浙江和广西是我国三叶青两大主要产区，两区域所产三叶青在市面及临床上应用较广；同样，两产地三叶青因较远的物理距离导致其在生物学性状及药效方面存在较大差异[9-10]。本研究对浙江与广西两产地三叶青水提物进行抗肺癌效果的对比分析，为三叶青质量标准制定、道地药材标定及临床合理应用提供一定的数据支持。

1 材料

1.1 实验药物 浙江产三叶青2018 年12 月采自浙江台州温岭市；广西产三叶青 2018 年12 月采自广西河池天峨县；由浙江省中医药研究院中药研究中心李洪玉研究员鉴定为葡萄科崖爬藤属Tetrastigmahemsleyanum三叶青的块茎。新鲜三叶青块茎洗净后晾干，切片后于55 ℃ 下烘干备用。水煎液制备：取上述两产地三叶青切片各200 g，置于 10 倍量水(2 000 mL)浸泡30 min 后，武火煮沸后文火煎煮 1.5 h，共煎煮 2 次，合并两次煎液，纱布过滤后，滤液在水浴锅上浓缩至 400 mL，使成为0.5 g生药/mL浓度，冰箱保存备用。

1.2 细胞株及动物 人肺腺癌细胞株 A549：购自中国医学科学院上海细胞库。SPF级BALB/c裸鼠，雄性，6～8 周龄，体质量18～22 g，购自上海斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号为SCXK(沪)2017-0005。以裸鼠专用饲料、灭菌水，于25 ℃室温条件下喂养，自由取食饮水，1 周后取用。

1.3 实验试剂及仪器 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；蛋白抗体：艾博抗上海贸易有限公司；PBS、DAB、苏木精、多聚甲醛：武汉博士德生物工程有限公司。SQP 十万分之一电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；游标卡尺：上海永准电子科技有限公司；BX63 荧光显微镜：日本Olympus公司；RM2235石蜡切片机：德国莱卡仪器有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备与分组给药 取对数生长期A549 细胞，以PBS 液调节成浓度为2×107/mL 的单细胞悬液，35只小鼠按每只0.2 mL接种于裸鼠前肢右腋下，构建 A549小鼠肿瘤移植瘤模型。小鼠接种2 周待肿瘤生长至 60～140 mm3后，取成模的 30 只裸鼠随机分为5 组：模型对照组、10 g/L 浙江产三叶青水煎液组、50 g/L浙江产三叶青水煎液组、10 g/L广西产三叶青水煎液组、50 g/L广西产三叶青水煎液组，每组6只。各组每日灌胃 1 次，对照组给予同实验组等体积的生理盐水，各组每隔2 d称量体质量1 次并进行记录。给药期间密切关注小鼠体质量、活动能力及摄食饮水等情况；连续给药1 周。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 移植瘤体积、瘤重及抑瘤率 给药1 周后，颈椎脱臼处死小鼠，小心剥离瘤体，称重、测量体积并拍照，计算肿瘤平均瘤重量、平均瘤体积及抑瘤率。

抑瘤率=(对照组瘤体体积-实验组瘤体体积)/对照组瘤体体积×100%

抑瘤率=(对照组瘤体重量-实验组瘤体重量)/对照组瘤体重量×100%

2.2.2 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡 将肿瘤组织用 4% 多聚甲醛固定，制成切片后，采用 TUNEL 法检测A549 肺癌裸鼠皮下移植瘤内细胞凋亡情况。经显色、复染、脱水、透明与封片后于荧光显微镜下观察，以细胞核中出现绿色荧光颗粒者为阳性，即为凋亡的细胞。每张切片至少观察 5 个以上高倍视野，每个视野在荧光显微镜下用 520 nm 波长拍照1 次，使用 Image-Pro Plus 6.0 进行荧光分析。计数500 个以上完整癌细胞，计算每 100 个癌细胞内阳性细胞数，即为凋亡指数(apoptopic index，AI)，即凋亡细胞数占细胞总数的百分比。

2.2.3 免疫组化检测瘤组织Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达 PBS 作为漂洗液，Bcl-2、Bax、Caspase3和 Caspase9 一抗工作浓度分别为1∶150、1∶150、1∶100和1∶100。一抗孵育 4 ℃ 过夜，镜下控制染色，DAB 显色，苏木精复染。判断标准以出现棕黄色颗粒为阳性反应，无染色反应者为阴性。使用 Image-Pro Plus 6.0软件以阳性细胞所占百分率和显色强度为标准，计算蛋白的阳性率。

3 结果

3.1 两产地三叶青水煎液对A549 肺癌裸鼠移植瘤生长抑制效果比较 结果见表1。

表1 各组裸鼠抑瘤效果比较

3.2 两产地三叶青水煎液对肺癌 A549 裸鼠移植瘤体内肿瘤细胞凋亡的影响 结果见表2。

表2 各组裸鼠肺癌 A549 移植瘤体内肿瘤 细胞凋亡的比较

3.3 两产地三叶青水煎液对 A549 肺癌裸鼠移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表达的影响 见图1，表3。

图1 各组裸鼠A549 肺癌移植瘤组织Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的免疫组化检测(×200)

表3 各组裸鼠A549 肺癌移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表达的比较

4 讨论

三叶青以其优良的清热解毒、消肿止痛、化痰等特性，常用于癌症、结节、各类炎症、肝病等疾病的治疗，同时还具有增强人体免疫力的功效[11]。就药效与品质而言，很多报道以浙江所产三叶青为最佳，但相关报道缺少足够的实际临床疗效对比及有效研究数据支撑。本研究通过三叶青水煎液处理A549肺癌移植瘤裸鼠的方法于体内就浙江产三叶青与广西产三叶青肺癌抑制效果进行了对比研究。研究结果可见：两产地三叶青水煎液对小鼠A549 肺癌移植瘤均有增长抑制作用且呈现剂量依赖性；但浙江产三叶青水煎液对肺癌肿瘤组织增长抑制效果显著，抑制作用优于广西产三叶青水煎液。诱导肿瘤组织细胞凋亡实验结果显示：三叶青水煎液肿瘤抑制作用与其诱导肿瘤细胞凋亡的作用存在密切关系，且浙江产三叶青水煎液诱导肿瘤细胞凋亡效果显著，细胞凋亡诱导作用优于广西产三叶青水煎液。抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞发生凋亡的机制与其上调促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9表达及下调抑制凋亡因子 Bcl-2存在密切关系；Bcl-2与Bax是 Bcl-2 家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，Bcl-2/Bax 比值对决定细胞是否进入凋亡状态具有重要的意义，而Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族中引起凋亡的关键成分[12-13]。本研究结果显示浙江产三叶青水煎液诱导肿瘤组织细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax上调表达及Bcl-2下调效果要显著优于广西产三叶青水煎液，这是浙江产三叶青水煎液具有显著诱导肿瘤细胞凋亡效果的重要原因之一。

综上所述，浙江产三叶青水煎液在肺癌肿瘤组织生长抑制、细胞凋亡诱导效果方面要显著优于广西产三叶青水煎液；因此，在临床三叶青组方使用时，应当明确其产地来源而确定用药量才能达到更好地治疗效果。