磷石膏对煤矸石微生物肥料养分含量的提升效果研究

张景宁，李小军，盛定红，王应兰，吉 俐，董丽敏，谢承卫

（贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

我国作为煤炭开采大国，在煤炭开采过程中产生大量煤矸石，煤矸石通常堆存处置，未得到有效利用。这不仅会造成土地资源的浪费，还会污染环境［1］。以煤矸石作为原料制备微生物肥料，不仅可以提高作物产量，还能改善作物品质，降低病虫害发生率，保护农田生态环境等［2］。

当前，煤矸石微生物肥料主要是以煤矸石为原料，采用单一解磷微生物制备［3］。此方法虽然提高了肥料中有效氮磷钾含量，能提高农作物产量［4］，但对农作物的品质改善不显著［5］，且对煤矸石中磷的解离效率较低，煤矸石肥料中w（有效磷）在118～185 mg/kg［6-7］。而有研究表明磷石膏可以降低土壤碱性［8］，间接地影响农作物的品质［9］。向煤矸石中掺杂磷石膏可以调整煤矸石的酸碱度，提升解磷菌对煤矸石的解磷效果。目前鲜有利用解磷菌处理掺杂磷石膏的煤矸石制备肥料的研究报道。本研究主要目的是探究磷石膏对煤矸石微生物肥料养分含量的提升效果。

1 材料和方法

1.1 菌种

研究所用的GZU-art01菌株是从废弃煤渣草坪根际土壤提取，经过分离、培育、筛选而得到。

1.2 煤矸石和磷石膏样品

1.2.1 煤矸石

研究所用煤矸石来自贵州省六盘水市煤矸石堆场，其主要成分见表1。

表1 煤矸石中主要矿物成分［6］ %

1.2.2 磷石膏

研究所用磷石膏为陈旧磷石膏，来自开阳磷矿磷石膏尾矿坝，pH约为4.2。由于磷石膏的pH过低，直接用细菌处理，会导致细菌存活率降低，故将磷石膏掺入煤矸石中再用细菌处理，以确保细菌的存活率。

1.3 方法

1.3.1 菌株提取分离

初筛：用无机磷固体培养基进行初筛。

复筛：以商业菌株巨大芽孢杆菌为对照菌株，用沙培法进行复筛，筛选出解磷效果好的菌株。

1.3.2 菌株鉴定

提取GZU-art01菌株的总DNA，并将其通过引物进行菌落聚合酶链式反应（即PCR扩增反应）［9］，反应条件见表2。

表2 PCR扩增反应条件

将获得的PCR产物寄送至测序公司进行DNA序列测试。测序结果在NCBI基因库中对比分析基因序列，使用MEGA5.05软件基于邻接法构建GZU-art01菌株的系统进化树，并结合细菌生理生化实验结果对细菌进行定种。

1.3.3 单因素实验

（1）确定磷石膏的最佳掺比：按不同比例分别称取煤矸石和磷石膏样品，共计10 g。其中0表示纯煤矸石样品，100%表示纯磷石膏样品，测量掺入磷石膏后煤矸石中的有效磷含量。

（2）细菌的耐酸耐碱实验：将细菌接种于不同pH的培养基中培养（24±2）h后，用未接种的LB液体培养基作空白对照，在600 nm波长处进行光电比浊测定，得出细菌在不同pH下的存活情况。

1.3.4 煤矸石肥料的制备

根据单因素实验确定因素的变化范围，设计GZU-art01菌株的L9（4）3正交实验。根据正交实验结果得到菌株处理煤矸石和掺杂磷石膏的煤矸石的最优条件，以此来制备煤矸石肥料。将菌株GZU-art01接种于LB固体培养基上培养至对数期末期后取出。然后在培养基中加入适量无菌水，用L型玻璃棒刮洗，将细菌制成菌悬液。GZUart01菌株菌悬液浓度调节至最优条件，将菌悬液与10 g煤矸石和掺杂30%磷石膏的煤矸石混匀，并用1 mol/L HCl和NaOH调节体系pH，放入35℃恒温培养箱中培养相应时间后，取出于35℃烘干。

1.3.5 煤矸石肥料中有效氮磷钾含量的测定

按照《土壤分析技术规范》［10］中方法对经细菌处理过的煤矸石及掺杂磷石膏的煤矸石进行养分测定，包含有效磷、速效钾、水解氮。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 菌落形态、菌体形态

GZU-art01菌株在LB固体培养基上的菌落形态和菌体形态如图1所示。

图1 GZU-art01菌株的菌落形态和菌体形态

从图1可知，GZU-art01菌株在LB固体培养基中的菌落为米黄色，不透明，菌落形态呈椭圆形，较湿润。通过革兰氏染色在显微镜下观察，菌体较细，无芽孢，鉴定为革兰氏阳性菌。细菌的扫描电镜图像显示细菌形态为短杆状，长度约1.8μm，菌体表面有细微螺旋状褶皱。

2.1.2 细菌生理生化实验

对GZU-art01菌株进行一系列生理生化鉴定（均用微生物生化鉴定管进行实验），其结果见表3。

表3 GZU-art01菌株的生理生化特性

2.1.3 GZU-art01菌株的16SrRNA鉴定

根据DNA序列检测结果，构建的GZU-art01菌株的系统发育进化树如图2所示，GZU-art01菌株与节细菌属Arthrobacter bambusae KF150696在同一个分支上，具有较高的同源性，结合细菌生理生化实验结果可以得出，挑选的菌株为Arthrobacter bambusae。

图2 GZU-art01菌株的系统发育进化树

2.2 单因素实验

2.2.1 磷石膏的最佳掺比

不同磷石膏掺比下，煤矸石有效磷含量的变化见图3。

图3 掺入不同比例磷石膏后煤矸石的有效磷含量

从图3可知，在磷石膏掺比为30%时，煤矸石有效磷含量最高，故确定磷石膏掺比为30%。

2.2.2 细菌的耐酸耐碱实验

菌株的耐酸耐碱性如图4所示。由图4可知，提取出的细菌在pH为6和7时，细菌活性较好，更利于对煤矸石中磷的解离。

图4 GZU-art01菌株的耐酸耐碱性

2.3 菌株解离煤矸石制备肥料

煤矸石中的磷主要以难溶形式的矿物存在，GZU-art01是一株好氧型解磷菌，能够将煤矸石中的磷转化为可供植物吸收的有效磷。煤矸石的粒径、体系pH、细菌接种量及培养时间均能影响解磷效果。因此，设计如下正交实验以探究GZU-art01处理煤矸石和掺杂磷石膏的煤矸石的最佳条件。

2.3.1 GZU-art01菌株解离煤矸石的正交实验及结果

分别用GZU-art01菌株处理煤矸石和掺杂30%磷石膏的煤矸石，正交实验结果见表4和表5。

表4 GZU-art01菌株处理煤矸石的正交实验结果

据表4、表5可知，用GZU-art01菌株处理煤矸石的最佳条件为：pH=6.5，细菌接种量为9.730×107～1.278×108cfu/mL，煤矸石粒径为0.250 mm，培养时间为1 d。各因素对结果的影响：细菌接种量＞培养时间＞煤矸石粒径＞pH。处理掺杂30%磷石膏的煤矸石的最佳条件为：pH=7.0，细菌接种量8.340×107～1.095×108cfu/mL，煤矸石粒径为0.250 mm，培养时间为3 d。各因素对结果的影响：培养时间＞煤矸石粒径＞细菌接种量＞pH。对比可知在适宜细菌（GZU-art01）生存的pH条件下，掺杂磷石膏后培养时间对煤矸石解磷效果的影响增加，细菌接种量对煤矸石解磷效果的影响降低，这也从侧面说明掺入磷石膏能够促进煤矸石中磷的解离。

表5 GZU-art01菌株处理掺杂30%磷石膏的煤矸石的正交实验结果

2.3.2 煤矸石肥料的制备及肥效指标测定

分别测定最佳工艺条件下，GZU-art01菌株处理煤矸石和掺杂30%磷石膏的煤矸石制备微生物肥料中的氮磷钾含量，结果如图5所示。图中的“原样”是未经任何处理的煤矸石样品；“煤矸石”表示经GZU-art01菌株处理的煤矸石肥料；“后掺”表示用细菌处理煤矸石后再掺杂30%磷石膏制得的煤矸石肥料；“先掺”表示先掺杂30%磷石膏再用细菌处理制得的煤矸石肥料。

图5 煤矸石肥料中氮磷钾含量

由图5可知，相比于未经细菌处理的煤矸石样品，GZU-art01处理过的煤矸石肥料、细菌处理后掺杂磷石膏的煤矸石肥料、掺杂磷石膏后用GZUart01菌株处理的煤矸石肥料水解氮、有效磷、速效钾均有较大提升。其中先掺杂磷石膏后用细菌处理制作肥料的方法，对提升煤矸石肥料中的氮磷钾含量最显著，较煤矸石原样分别提升6.52倍、19.41倍、2.46倍，均高于后掺磷石膏和单一细菌处理的煤矸石肥料。

3 结论

（1）利用GZU-art01菌株处理煤矸石制备肥料，能够提升肥料中氮磷钾含量。（2）当磷石膏掺比量为30%时，有效磷含量最高。（3）先掺杂磷石膏后用GZU-art01细菌处理来制备肥料的方法，对煤矸石肥料中的氮磷钾含量提升最显著，较煤矸石原样分别提升6.52倍、19.41倍、2.46倍。（4）掺杂磷石膏可以提升解磷菌对煤矸石的解磷效率，不仅提升煤矸石肥料中的有效氮磷钾含量，还能提高煤矸石微生物肥料的品质。这也是对煤矸石和磷石膏资源化利用的一种新方式。