关于D-二聚体检测中假阳性与假阴性问题的探讨

颜 楠，韩 峰，刘家云

空军军医大学附属西京医院检验科，陕西西安 710032

D-二聚体(D-D)是交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下形成的一种特异性降解产物[1]。在凝血级联反应过程的后期，纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成纤维蛋白单体(FM),它们彼此以氢键发生聚合形成纤维蛋白单体聚合物(SFM)。 SFM在FXⅢa和钙离子作用下，最后形成交联纤维蛋白凝块[2]。在纤溶酶的作用下，除了生成X′、Y′、D、E′碎片外，还生成D-D及不同相对分子质量的D-D片段复合物，这些产物统称为纤维蛋白降解产物(FDP)[3]。D-D检测尽管其诊断特异度不高，但灵敏度高，阴性预测值高，使其在活动性深静脉血栓形成和肺栓塞(PE)的排除诊断、弥散性血管内凝血(DIC)的诊断、原发与继发性纤溶的鉴别诊断、溶栓治疗检测等方面都具有重要价值[4]。目前，D-D 检测方法多样，包括半定量胶乳凝集法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法、基于胶乳凝集的免疫比浊法等[5]。因胶乳凝集的免疫比浊法可以定量，灵敏度高、试剂稳定、价格适中、检测快速，目前应用最广泛[6]。

Sysmex CS5100在全国大中型医院已被广泛使用，检测D-D的方法多为免疫比浊法[7]，其原理均是基于抗原抗体按一定分子比例结合的反应。当D-D水平显著升高时，会出现钩状效应而造成假阴性结果。因此，及时对水平过高的标本进行稀释处理才能确保高水平D-D临床标本检测的准确性。

因FDP为纤维蛋白原与交联纤维蛋白降解产物的总称，而D-D仅为交联纤维蛋白的降解产物，所以在理论上FDP水平应大于D-D水平，但近些年D-D假性增高现象越来越多，使FDP与D-D水平出现倒置现象。因同一种D-D检测系统与试剂盒有时也存在一定的方法学局限性，易受各种干扰因素的影响，给临床诊断造成误判，给临床医生与检验人员带来极大的困扰。虽然本实验室使用的试剂中加入了异嗜性抗体(HA)的封闭试剂，但也不可保证将干扰完全排除。作为实验室检验人员，当遇到FDP与D-D结果倒置的情况时，要及时对结果做出正确的分析与判断，并通过稀释等办法及时进行纠正，使D-D检测能够得到一个相对准确的结果。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2019年4月至2020年10月门诊与住院患者，分为D-D假阳性组和D-D假阴性组，D-D假阴性组收集D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL范围内的结果50例，男26例，女24例，年龄25～57岁，平均(42.24±14.08)岁；D-D>5～10 mg/L,FDP>20 μg/mL范围内的结果50例，男29例，女21例，年龄33～63岁，平均(45.44±10.08)岁；D-D>10 mg/L,FDP>20 μg/mL范围内的结果50例，男27例，女23例;年龄42～71岁，平均(54.24±12.21)岁。D-D假阳性组收集D-D与FDP结果倒置的患者35例，男11例，女24例，年龄25～60岁，平均(44.49±10.67)岁。所有患者均排除溶血、黄疸、脂血与高水平类风湿因子(RF)等影响的标本[8-9]。

1.2仪器与试剂 仪器为日本Sysmex公司生产的Sysmex CS5100全自动凝血分析仪。D-D检测试剂盒与质控品均为德国Siemens公司生产。FDP检测试剂盒与其质控品为日本积水医疗株式会社生产。

1.3方法 D-D假阴性组：清晨空腹抽取1∶9枸橼酸钠抗凝血。1 500×g离心15 min后分离血浆，采用日本Sysmex公司生产的Sysmex CS5100全自动凝血分析仪及相应的配套试剂进行检测。选取本院2019年4月至2020年10月门诊与住院病例，分别收集D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL范围内的结果50例；D-D>5～10 mg/L,FDP>20 μg/mL范围内的结果50例；D-D>10 mg/L,FDP>20 μg/mL范围内的结果50例。将3种范围的D-D结果分别进行各梯度稀释检测并计算回收率。

D-D假阳性组：清晨空腹抽取1∶9枸橼酸钠抗凝血。1 500×g离心15 min后分离血浆，采用日本Sysmex公司生产的Sysmex CS5100全自动凝血分析仪及相应的配套试剂进行测定。选取本院2019年4月至2020年10月门诊与住院患者，收集D-D与FDP结果倒置的患者35例，将D-D与FDP结果分别进行各梯度稀释检测并计算回收率。

2 结 果

2.1假阴性组 将收集好的范围在D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL的标本(共50例)经仪器固定稀释模式(1/8、1/16)分别做D-D稀释检测，然后将D-D稀释后的结果分别与原倍结果进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，且计算回收率均在(100±10)%范围内。将收集好的范围在D-D>5 mg/L,FDP>20 μg/mL范围内的标本(共100例)经仪器固定稀释模式(1/8、1/16)分别做D-D稀释检测，然后将D-D稀释后的结果与原倍结果进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且计算回收率均不在(100±10)%范围内。见表1。

表1 3种收集范围的D-D原倍与稀释后的结果比较

2.2假阳性组 将收集好的D-D与FDP结果倒置的患者35例，经仪器固定稀释模式(1/8、1/16)分别对D-D与FDP结果做稀释检测，然后将其稀释后的结果分别与原倍结果进行比较，其中 D-D原倍结果与各梯度稀释后结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且回收率均不在(100±10)%范围内。FDP原倍结果与各梯度稀释后结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且回收率均在(100±10)%范围内。见表2。

表2 D-D、FDP原倍与稀释后的结果比较

3 讨 论

免疫比浊法检测D-D的原理是当试剂与含有D-D片段复合物的标本混合时，用单克隆抗体共价包被的聚乙烯颗粒凝集；D-D交联的区域具有立体对称的结构，即单克隆抗体作用的抗原表位出现2次。因一个抗体有足够能力触发凝集反应，浊度的升高可以用比浊法检测，用吸光度表示。与标准曲线比较，最后转换成待检物质的水平。由于D-D是交联纤维蛋白降解的最小产物，不同厂家试剂检测的是不同相对分子质量的D-D片段的复合物而不是大家通常认为的D-D最小片段。因此，不同厂家试剂很难做到检测结果的一致性。每个商品化的D-D分析体系都有自己独立的用于静脉血栓排除性诊断的医学决定水平,目前尚无通用的标准品或校准物[10]。

本实验室检测D-D的方法为免疫比浊法，免疫比浊法的原理是基于抗原抗体的反应。而抗原抗体反应特点中的比例性是指抗原与抗体只有在比例合适的范围结合才是最充分的，此时形成的复合物快且多，称为“等价带”。如果抗体或抗原过量，形成的沉淀物少，上清液中可测出游离的抗体或抗原，这种现象称为“带现象”[11]。经本文验证，当在D-D>5 mg/L,同时FDP>20 μg/mL的情况下FDP水平越高，患者血浆中的含D-D片段复合物也就越多，即D-D存在“抗原过量”现象。此时检测得到的结果并不是真实的D-D水平。及时对“抗原过量”的标本进行稀释处理才能确保高水平D-D临床标本测定结果的准确性。由于稀释倍数越大，结果准确性越低，建议选择较小的稀释倍数进行检测。

在检测中当遇到D-D与FDP结果不匹配的现象时，这是由于各个科室的患者存在个体差异，各个检测试剂盒与各个检测系统的检测局限性等因素共同导致的。在免疫法测定中，影响结果的干扰因素较多[12]，这些干扰因素是一些与被检物质化学结构不同但活性相似的物质，如HA[13]、RF[14]、自身抗体、和其他蛋白等[15]。其中HA是通过已知或未知抗原刺激机体产生的一类高滴度、能与多个物种的免疫球蛋白发生相对较弱结合的多重特异性免疫球蛋白[16-17]，人抗动物抗体的产生通常有已知的动物免疫球蛋白治疗史或接触史，而HA通常包含天然抗体和因接触未知的动物蛋白而产生的自身抗体，目前所使用的免疫试剂抗体大多源于实验动物,体内含HA的患者在做免疫检测，HA通常与试剂抗体的Fc区表位或V(a b′) 2区域的决定簇结合从而对结果造成干扰。而RF是一类以自身变性IgG为靶细胞的抗体，是一种经典的人免疫球蛋白，可以分为 IgM、IgA、IgG及IgE 4类。RF可与IgG Fc片段结合，与抗体发生聚集作用是RF干扰机制之一[18]。RF能桥联捕获抗体和检测抗体从而引起干扰，能结合IgG分子Fc片段的抗原决定簇，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集反应。针对这些干扰因素虽然可以通过稀释法、使用异嗜性抗体阻滞剂、阻断试剂盒等方法来消除一定的干扰[19]，但是由于标本中干扰物质的来源是未知的，不能够准确地针对其结合位点进行操作，所以目前尚未有一个完全消除干扰的方法。如果标本中干扰物质的水平不是很高，且它所造成的干扰不是很大时，稀释法是一种简单易行减少干扰的方法，但可能不能完全消除。经本研究验证，对FDP与D-D出现倒置的标本进行稀释后，确实降低了干扰物质的水平，原有的干扰强度可明显减小。当遇到此种情况时可以通过将D-D与FDP结果同时稀释的方法来解决倒置的问题。但如果个别标本通过此方法仍然无法解决，要积极了解患者的相关病史，看患者是否患有免疫相关的疾病与有无用药等情况，有条件的实验室可通过其他可以排除干扰的办法来解决。如果暂时未能找到原因，发出报告时要做好备注并与临床医生进行详细的沟通，为其讲解本实验方法学存在局限性的可能，请其结合患者的病史、临床表现与其他检查结果一起综合分析。

在检测D-D时一定要联合检测FDP，否则将无法对D-D的检测结果是否存在假阴性或假阳性做出正确判断。D-D不是一个完全独立的指标，单靠这一个指标不能完整地诊断患者病症，需要结合病史、其他检查才能对患者做出一个全面、综合的评估。检验工作者需要加强与临床医生的沟通，对标本结果做出合理的解释，也能帮助临床给出合理的诊疗方案。保证实验室检测结果的准确性只是日常工作中的一部分，通过实验室与临床的共同合作，互相沟通，可以及早对患者进行诊断与治疗，减少患者痛苦，让患者花最短的时间、最少的费用得到最好的诊治，才能实现实验室与临床工作的真正价值。