东莞地区幽门螺杆菌感染儿童的抗生素耐药基因突变现状调查＊

陈彭亮 刘旻 李桢 邹姒妮 张勇

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）为一种革兰阴性菌，常见于上消化道，具有传染性及致病性，是多种慢性消化道疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤、胃癌等疾病的主要致病因素[1]。全球约有50%的人存在H.pylori感染，我国H.pylori感染率也高达56.2%[2-3]。儿童期是H.pylori感染的关键时期，有研究表明，我国有消化道症状的儿童H.pylori感染率为29.2%～53.2%，呈逐年递增的趋势[4]，12岁以上感染率显著上升[5]。因此，儿童幽门螺杆菌感染的治疗对降低H.pylori感染率具有重要意义。目前我国H.pylori感染治疗主要以至少两种抗生素组成的根除治疗方法，但随着根除治疗的广泛开展，幽门螺旋杆菌对抗生素耐药的问题也逐渐引起重视，如何合理应用抗生素、提高H.pylori感染的根治率已成为临床医生重点关注的问题。本研究旨在分析东莞地区H.pylori感染儿童克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林的耐药基因突变情况，并比较不同性别儿童携带H.pylori抗生素耐药基因的差异，为东莞地区H.pylori感染的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年12月-2021年1月本院收治的H.pylori感染患儿84例，年龄1～14岁，平均（6.69±2.83）岁。纳入标准：（1）13C呼气试验、胃快速尿素酶检查确诊为H.pylori感染阳性；（2）年龄≤14岁；（3）伴有明显的消化不良症状，包括恶心、呕吐、腹胀及反酸等；（4）检查前1个月内未用抗生素、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂、非甾体消炎药等药物。排除标准：（1）活动性出血；（2）对本研究所用药物有过敏史；（3）存在其他影响本研究结果的严重疾病，如肝、肾、肺及心等脏器损害等。本研究方案经伦理委员会批准，患儿家属对研究内容知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 粪便中H.pylori DNA的提取及质量控制 称取200 mg标本在冰水中解冻，悬浮于5 ml磷酸钠缓冲液中，并充分涡旋混匀，放在离心机离心后取上清液，然后用缓冲液洗涤，加入溶菌酶溶解细菌后再离心，取沉淀液，此时沉淀液应含有蛋白和核酸等细菌裂解物，马上加入苯酚、氯仿溶液，混匀，提取核酸等物质，离心后的沉淀物便是核酸提取物，用无水乙醇洗涤沉淀物，晾干后用无菌水溶解，对提取的DNA溶液取部分用紫外光光度计检测并用细菌通用序列16sDNA进行PCR扩增，电泳扩增物，检验提取的DNA质量。确认有DNA后将提取液样品置于-20 ℃下保存备用。

1.2.2 耐药基因的检测 克拉霉素耐药基因为23sRNA，甲硝唑耐药基因为rdxA，阿莫西林耐药基因为PBP1A，获得3个基因的引物序列，见表1，对以上提取的DNA溶液分为3份，分别进行巢式PCR扩增，扩增反应条件：94 ℃ 3 min，72 ℃、5 min。扩增目标基因的序列后，行琼脂糖凝胶电泳提纯，与标准菌株扩增的电泳条带对比，切割出目标基因条带，此条带就是目标基因序列的PCR产物，对此产物回收及进行Sanger法测序，并与正常基因序列作Clustal W2对比，了解有无基因序列的变异。

表1 引物设计表

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同性别患儿感染情况

84例确诊为幽门螺旋杆菌感染患儿入组，其中8例患儿粪便标本不合格，故不将其纳入本研究内。因此，最终入组76例H.pylori感染患儿，平均年龄（6.84±2.81）岁，男37例，占48.7%；女39例，占51.3%。

2.2 不同抗菌药物的耐药情况

本次研究中，抗菌药物耐药基因发生突变者共46例，基因突变率为60.5%，克拉霉素耐药基因突变者有29例，基因突变率为38.2%；甲硝唑基因突变者有6例，基因突变率为7.9%；阿莫西林基因突变者有7例，基因突变率为9.2%，发生两种以上抗生素基因突变者4例，基因突变率为5.3%，见表2。经Pearsonχ2检验，克拉霉素的耐药基因突变率高于甲硝唑、阿莫西林耐药基因突变率及多重耐药基因突变率，差异有统计学意义（χ2=42.316，P＜0.05）。甲硝唑耐药基因突变率与阿莫西林耐药基因突变率相近，差异无统计学意义（χ2=0.084，P＞0.05）。

表2 76例不同抗菌药物的耐药情况 例（%）

2.3 抗菌药物耐药的性别差异

男、女患儿的克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林的耐药基因突变率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 抗菌药物耐药的性别差异 例（%）

3 讨论

H.pylori感染在我国具有较高的感染率，并与多种消化系统疾病具有密切联系[1]，因其具有传染性，过高的H.pylori感染率引起了社会的广泛关注，降低H.pylori感染率已成为亟须解决的公共健康问题。国内外多项研究表明，儿童期是H.pylori感染最重要的年龄阶段，有2/3的H.pylori感染发生于10岁以前，因此，根除儿童H.pylori感染可减少消化道相关疾病的发生及发展[7]。目前，国内外H.pylori根除方案中常用的抗生素主要包括甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、四环素、左氧氟沙星等，儿童可选择抗生素的种类有限，同时随着抗生素在H.pylori感染根除治疗中的广泛应用，导致耐药菌的产生，近年来H.pylori抗生素耐药问题日趋严重，H.pylori感染的根治率也不断下降。因此，如何在治疗过程中提高Hp根除率，避免耐药菌的产生，成为一项重要的研究议题。

成人H.pylori感染研究资料显示，克拉霉素及甲硝唑的耐药率在全国范围均比较高，不同国家不同地区对抗生素的耐药性均存在不同程度的差异[8]。H.pylori对克拉霉素耐药主要由23SrRNA基因Ⅴ功能域的点突变引起，导致克拉霉素与核糖体亚基的结合力下降，不能阻断肽链的延伸，从而无法达到杀菌目的[9]，常见的点突变位点为A2143G、A2142G及A2142C[10]。H.pylori对甲硝唑的耐药机制主要为rdxA基因突变，其突变导致NADPH还原酶活性降低，从而产生耐药[9]。PBP1突变是阿莫西林耐药基因突变的常见形式，通过转移青霉素结合基序影响H.pylori对阿莫西林的耐药性[11]。但阿莫西林作为临床常用药物，H.pylori对其耐药性却显示出与其既往用药史无明显相关性，提示H.pylori对阿莫西林继发性耐药发生率较低[9]。本研究中发现H.pylori感染患儿对克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林均有不同程度的耐药基因突变情况出现，其中克拉霉素耐药基因突变率为38.2%；甲硝唑耐药基因突变率为7.9%；阿莫西林耐药基因突变率为9.2%，多重耐药基因突变率为5.3%，以克拉霉素耐药基因突变率高于其余抗生素耐药基因突变率，且差异有统计学意义（P＜0.05），提示东莞地区可能属于克拉霉素高耐药地区。其原因可能在于克拉霉素突变位点较多，容易发生突变，导致较高的耐药基因突变率。由于甲硝唑剂型及患儿依从性的问题，临床上较少选择甲硝唑对儿童进行相关疾病的治疗，以致于该地区儿童对甲硝唑的耐药性普遍较低，这可能是本次研究中甲硝唑耐药基因突变率较低的原因；此外，也有研究表明，除了rdxA基因突变以外，frxA基因突变也与甲硝唑耐药形成相关[12]，还需进一步分析甲硝唑的耐药机制。本次研究中也得出阿莫西林耐药基因突变率较低的结论，与任小舟等[9]研究结果相符合。同时，本次研究也出现克拉霉素和甲硝唑耐药基因同时存在情况，提示在H.pylori感染的治疗中，需充分考虑多重耐药的因素。

本研究通过分析不同抗菌药物耐药性的性别差异发现，克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林的耐药性与H.pylori感染患儿的性别无关，原因可能在于本研究仅纳入儿童H.pylori感染患儿，年龄段比较局限，该结论与前期文献[13]研究一致，未来将进一步分析抗生素耐药基因突变与H.pylori感染根除治疗的关系。同时，本研究仍存在一些不足，如样本量较少，需进一步扩大样本量探讨该地区的儿童H.pylori感染现状及携带耐药基因状况。

综上所述，东莞地区H.pylori感染患儿抗生素耐药基因突变主要以克拉霉素耐药基因为主，其可能影响H.pylori感染的治疗，且在后续治疗中应充分考虑双重耐药的因素。