梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

王楠楠，董 彬，杨丽媛，赵宏波

（1. 浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江农林大学 浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江 杭州 311300；3. 浙江农林大学 南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，浙江 杭州 311300）

梅花Prunus mume是中国十大传统名花，在中国有3 000多年栽培历史，江南地区花期为2月左右[1]。梅花适应性较强，耐高温、较耐低温和干旱。在年均气温为16～23 ℃的地区生长最好，根系不耐−8 ℃以下的低温[2−3]。梅花适栽范围介于自然分布区和历史分布区之间，北界为西藏经四川至甘肃天水，陕西宝鸡、西安，河南洛阳，最后到山东烟台，通过海岸线与自然分布区相接，以长江流域为集中赏梅地带[2, 4]。在华北、东北和西北等北方地区不能露地越冬，在江南地区，春季的极端低温(低于−3 ℃)则会对花(蕾)造成伤害，极大地影响观赏价值。因此，抗寒育种一直是梅花育种的重要方向[4−6]。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的锌指型转录因子，在植物响应生物胁迫与非生物胁迫的过程中起着重要作用。根据WRKY结构域数量和锌指结构特征，WRKY家族可分为3类：I类包含2个WRKY结构域和 1个 CX4−5CX22−23HXH (C2H2)型锌指结构；Ⅱ类包含 1个 WRKY 结构域和 1个 CX4−5CX22−23HXH(C2H2)型锌指结构；Ⅲ类包含1个WRKY结构域和1个CX7CX23HXC (C2HC)型锌指结构[7]。WRKY家族参与了广泛的生物过程，包括种子萌发、植物发育和植物激素信号传递等[8]。研究表明：WRKYs最重要的功能之一是参与防御非生物胁迫[9]，可显著提高小麦Triticicum aestivum[10]、水稻Oryza sativa[11]等的耐寒性和香蕉Musa acuminate[12]、棉花Gossypium hirsutum[13]等的抗旱性。近年来，随着梅花基因组正式公布[14]，关于梅花抗寒和抗旱基因的挖掘和研究逐渐展开，这为深入研究梅花抗寒、抗旱等机制提供了重要的基础。梅花中共鉴定出58个WRKY成员，PmWRKYs在梅花的不同组织(根、茎、叶、花和果实)中有不同程度的表达，其中17个PmWRKYs可能是调控梅花抗寒性的潜在转录因子[15]。本研究以梅花品种‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’为材料，采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得了2个PmWRKY2转录因子，通过生物信息学分析和同源基因序列比对，检测PmWRKY2基因在不同非生物胁迫下的表达模式，以期为后续开展WRKY转录因子在梅花抗寒和抗旱方面的作用机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

梅花‘骨红朱砂’来自浙江农林大学梅花种质资源圃。采集生长势一致，无病虫害的1年生枝条，插于加入清水的培养瓶中，参照PENG等方法[16]处理，湿度为50%，光周期为16 h/8 h。低温(2 ℃)处理组取样时间为 0(ck)、1、2、4、6、12、24、48、72 h。采用 200 mmol·L−1的甘露醇溶液模拟干旱处理，取样时间为 0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。采用 100 μmol·L−1脱落酸 (ABA)处理，取样时间为0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。所有新鲜样品采集后立即用液氮速冻，保存于−80 ℃，3次生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及 cDNA 合成 RNA 的提取采用购自天津诺禾致源公司的 UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit，方法参照试剂盒的提取说明书。cDNA 的合成根据 TAKARA PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)说明书在冰上进行。

1.2.2 基因的克隆 通过梅花基因组和表达谱数据获得PmWRKY2-1和PmWRKY2-2序列，利用 Prime 5.0设计特异性引物(表1)，以‘骨红朱砂’叶片cDNA为模板，利用r-TaqDNA聚合酶进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 30 s，54 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 3 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经切胶回收试剂盒回收后连接到pMD18-T载体(Takara公司，大连)中，转化大肠埃希菌Escherichia coliDH5α感受态细胞后挑取阳性克隆，经PCR验证后送往杭州有康科技有限公司测序。

表1 基因克隆及表达所用引物序列Table 1 Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR

1.2.3 序列的生物信息学分析 采用在线软件 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行基因序列比对分析，用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线分析开放阅读框，运用ProtParam 在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白质的分子量、理论等电点；利用SOPMA 在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PmWRKY2蛋白质的二级结构组成；利用WOLFPSORT在线软件(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测基因的亚细胞定位；利用DNAMAN 9.0软件对梅花PmWRKY2蛋白质与其他物种WRKY蛋白质进行比对分析；使用ClutsalX-v1.83程序进行多序列比对，然后将比对结果输入到MEGA 6.0软件中，利用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树，Bootstrap值取1 000次。

1.2.4 基因表达分析 以不同处理的叶片为模板，反转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR。利用Prime 5.0设计PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的特异性引物，以梅花PmEF1α为内参基因。反应体系为SYBR Premix ExTaq酶 (Takara，大连)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物 (10 μm·L−1)各 0.8 μL，双蒸水 6.4 μL，每个样品设置 3次重复。反应程序为两步法：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 复性30 s，共 40个循环；然后以 95 ℃ 持续 5 s，60 ℃ 持续 1 min，95 ℃ 持续 15 s作为溶解曲线分析程序，最后根据 2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因的克隆及生物信息学分析

利用特异性引物进行PCR扩增，经过连接、转化、测序后获得编码序列(CDS)。测序结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的 CDS 长度分别为 2 223和 2 220 bp(图1)，编码的氨基酸数目分别为740和739个，蛋白质分子量分别为79.94和80.98 kD，理论等电点分别为5.65和5.82。不稳定系数分别为53.93和53.82，脂肪指数分别为54.18和59.53，预测它们为不稳定蛋白质。总平均亲水系数(GRAVY)分别为−0.774和−0.743，属于亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均位于细胞核。

图1 2个 PmWRKY2基因的扩增Figure 1 PCR amplification of 2 PmWRKY2 genes in P. mume

氨基酸序列比对结果显示(图2)：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的同源性仅为45.87%，与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtWRKY2相似性分别为51.26%和32.07%；其中PmWRKY2-1与欧洲甜樱桃P. avium(XP_021826759.1)、桃P. persica(XP_007206427.1)的WRKY2同源性分别为98.65%，98.78%；PmWRKY2-2与甜李P. dulcis(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY2同源性分别为98.51%，98.11%，与月季Rosa chinensis(XP_024188041.1)WRKY2同源性为77.97%。进一步分析发现：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列与其他植物氨基酸序列一样，均包含2个WRKY结构域和1个 CX4−5CX22−23HXH(C2H2)型 锌 指 结 构 ， 属 于Group Ⅰ (图 3)。

图2 梅花与其他物种 WRKY 氨基酸序列的比对Figure 2 Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species

图3 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2的 WRKY 结构域Figure 3 WRKY domain displays of PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2

2.2 梅花 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2蛋白的二级结构预测

蛋白质二级结构预测结果显示(图4)：PmWRKY2-1蛋白质的二级结构中包含75.68%的无规则卷曲、10.81%的α螺旋、10.41%的扩展长链和3.11%的β转角结构；PmWRKY2-2蛋白质的二级结构中包含74.02%的无规则卷曲、13.80%的α螺旋、8.80%的扩展长链和3.38%的β转角结构。

图4 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2蛋白质的二级结构Figure 4 Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2

2.3 系统进化分析

利用MEGA 6.0软件构建梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列的系统进化树(图5)。结果显示：梅花PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的相似性较低，但与一些蔷薇科Rosaceae植物的亲缘关系都较近；其中PmWRKY2-1与桃(XP_007206427.1)、欧洲甜樱桃(XP_021826759.1)的WRKY亲缘关系较近，PmWRKY2-2与甜李(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY氨基酸聚为一类，与麻疯树Jatropha curcas (XP_021629940.1)、酸枣Ziziphus jujube(XP_015875770.1)、蔓花生Arachis duranensis(XP_015962000.1)等 SUSIBA2-Like(sugar signaling in barley)基因的氨基酸序列也有一定的相似性。

图5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species

2.4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2在非生物胁迫和脱落酸处理下的表达

低温和干旱(甘露醇)处理后，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2表达均发生显著变化(图6)。在低温处理下，PmWRKY2-1在2 和12 h时表达量最高，分别是对照的5.0和4.4倍，之后呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量呈现先上升后下降的趋势，在6 h时达到最大值，是对照的2.4倍。在干旱处理下，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达模式均为先上升后下降的趋势，PmWRKY2-1的表达量在12 h达到最大且为对照的53.9倍，之后便呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量在6 h处达到最大，为对照的9.7倍，之后呈现下降趋势。在脱落酸(ABA)处理下，处理48 h前，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均显著下调(P＜0.05)，说明其表达可被ABA抑制。

图6 非生物和 ABA 处理下的 PmWRKY2-1和 PmWRKY2-2的表达Figure 6 Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA

3 讨论

植物在生长发育的过程中会受到多种因素的影响，而低温与干旱是常见的影响植物生长发育、果实品质以及地理分布的非生物胁迫因素，严重时可能会导致植物死亡。植物在长期适应进化的过程中逐渐形成了复杂而高效的应答机制，从分子、生理、细胞和生化等多方面做出适应性调整，以抵御和适应低温、干旱等胁迫。在植物响应低温、干旱胁迫过程中，普遍存在于植物中的WRKY转录因子发挥了重要作用[17]，目前已在拟南芥[7]、番茄 Solanum lycopersicum[18]、玉米 Zea mays[19]、苹果 Malus domestica[20]、水稻[21]等大多数物种中均有报道。

本研究克隆获得的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因都含有2个WRKY结构域，C端都为C2H2型锌指结构；但2个蛋白质序列的差异较大，相似性仅为45.87%；与一些蔷薇科植物的亲缘关系较近；PmWRKY2-1与拟南芥 AtWRKY2的相似性为51.26%，PmWRKY2-2为 32.07%。值得一提的是，PmWRKY2-2与麻风树(XP_021629940.1)、酸枣(XP_015875770.1)、蔓花生 (XP_015962000.1)等植物的SUSIBA2-Like氨基酸序列具有一定的相似性，有研究[22]报道SUSIBA2属于WRKY转录因子超家族并参与碳水化合物合成代谢。

罗昌国等[23]发现：低温处理下湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY40b基因表达量呈现先上升后下降的趋势；低温处理下黄瓜Cucumis sativus CsWRKY46[24]和水稻OsWRKY76[11]也呈现先上升后下降的表达趋势，与本研究中梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因对低温的响应趋势一致。干旱处理下PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达量先显著上升后下降，最高表达量分别上调了约50倍和10倍。ZHU等[25]发现：拟南芥中过表达甘薯Ipomoea batatas IbWRKY2和苦荞[26]Fagopyrum tataricum FtWRKY10能提高转基因植株的抗旱性；ZHANG等[27]发现：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)处理白车轴草Trifolium repens，其WRKY2作为干旱响应基因可以提高白车轴草的耐旱性。JIANG等[28]发现：ABI5、ABI3、ABA2和ABA3等ABA途径基因诱导拟南芥2个WRKY2的表达从而介导种子萌发和萌发后的发育停滞。本研究中，ABA处理下，梅花2个PmWRKY2基因的表达都被抑制，预测启动子序列中的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2分别含有1个和7个ABA响应元件ABRE，推测这2个基因可能通过ABA调控低温相关基因的表达进而调控梅花的耐寒性，但这些推论还需进一步验证。