乙型肝炎病毒e抗原定量检测的性能验证和临床应用探索

郭艺飞，胡尧，蒋祺蓉，黄铭颖，刘爱平，张继明

1. 复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040； 2. 复旦大学附属华山医院检验科，上海 200040

乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)由HBV 前C区或C区编码而成，经由内质网-高尔基体结构分泌至胞外。HBeAg既不是HBV颗粒的结构成分，也不是HBV DNA复制所必需的，但是发生HBeAg血清学转换是免疫控制的指标，也是评估慢乙肝治疗疗效的重要指标。此外，血清HBeAg的水平反应了病毒的复制水平，且HBeAg对于维持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的慢性感染至关重要。血清HBeAg与HBV DNA定量之间有显著相关性，即HBeAg阳性的患者绝大多数表现出HBV DNA阳性[1]。有研究表明，HBeAg阳性孕妇生产的子女即便接受了乙肝疫苗以及免疫球蛋白的阻断，相较于HBeAg阴性孕妇所生的子女而言，依旧具有较高的概率发生突破性HBV 感染[2]。《亚太地区慢性乙型肝炎(CHB)治疗指南2012》里明确指出，HBeAg和HBV DNA均是乙肝患者监测的常规检测项目[3]。2015年3月发布的WHO首部全球慢性乙肝指南里也强调了定期监测慢性乙肝患者HBeAg指标的必要性[4]。尽管目前已有大量临床研究验证了HBeAg定量检测对临床诊疗的重要性，HBeAg的定量检测还未成为常规检验项目。为了将HBeAg定量检测应用于临床，本研究对HBeAg定量检测平台进行了性能验证，评估了定量检测和定性检测结果的相关性，并对慢性乙肝患者样本进行HBeAg定量检测，观察其与血清HBV DNA水平、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)等结果的相关性，为HBeAg定量检测在临床诊疗的应用提供实验依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

标本来源为2019年3月至2019年5月来本院就诊的710例慢性乙型肝炎患者的血清。710例乙肝患者的HBeAg定性检测均为阳性，男性患者488例，女性患者222例，平均年龄(37.54±11.31)岁。根据血清学、病毒学和生物化学等检测结果有明确临床诊断的有98名患者，其中，78名患者处于免疫清除期，20名患者处于免疫耐受期[5]。关于98名患者的基线信息具体如表1所示。本研究经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准(编号：KY2015-212)。

1.2 方法

1.2.1 HBeAg定量检测分析性能验证本实验室首次使用雅培ARCHITECT HBeAg定量试剂在美国雅培ARCHITECT i4000SR全自动免疫分析仪上进行检测。因此，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)相关指南文件EP10A3，对HBeAg定量检测系统的精密度、分析灵敏度、线性范围/可报告范围、携带污染率进行分析和验证，来评估其检测性能是否满足实验室的常规使用要求。验证期间，已确认仪器运转良好，质控在控。

1) 精密度验证实验

取两个浓度的质控品作为验证材料连续检测5天，各浓度每天重复测定5次。每浓度水平获得25个数据。若计算的精密度小于等于厂商声明的质量要求，则验证通过。

表1 98名有明确临床诊断患者的基线资料

2) 分析灵敏度验证实验

将ARCHITECT HBeAg定量手工稀释液作为“0”浓度样品，连续测定20次，重复测定已知浓度样本(0.7 PEIU/mL)3次，记录“0”浓度和已知浓度测定结果的相对光单位(relative light unit, RLU)值。如果计算的分析灵敏度≤厂家声明，则验证通过。

3) 线性范围

厂商声明的线性范围是1～700 PEIU/mL，取已知浓度的患者高值(H)、低值(L)标本各一份(高值标本浓度为696 PEIU/mL，低值标本浓度为2 PEIU/mL)。将L和H按照如下方式进行配比：5L+0H，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，0L+5H，组成6份验证物质。测定该验证物质浓度，每份重复测定2次。线性可允许系统误差要求 ≤1/2 TEA，TEA=25%。

4) 携带污染率

取高浓度样本(H)和低浓度样本(L)各一份，将高浓度样本分成10份，低浓度样本分成11份，21份样本按顺序：L1-L2-L3-H1-H2-L4-H3-H4-L5-L6-L7-L8-H5-H6-L9-H7-H8-L10-H9-H10-L11连续测定。携带污染 =High-Low的均值-Low-Low的均值，即(L4+L5+L9+L10+L11)/ 5-(L2+L3+L6+L7+L8) / 5，携带污染 < 3 倍Low-Low的SD则验证通过。

1.2.2HBeAg定性测定

本实验室HBV血清标志物检测常规采用美国雅培ARCHITECT i4000SR全自动免疫分析仪以及乙型肝炎病毒e抗原测定试剂盒。患者血清样本经实验室常规HBeAg定性检测之后，结果判定阳性标准为HBeAg S/CO 值≥1.0，HBeAg S/CO 值<1.0 为阴性。

1.2.3HBeAg定量测定

取HBeAg定性检测结果判定为阳性的患者样本，采用美国雅培ARCHITECT i4000SR全自动免疫分析仪、乙型肝炎病毒e抗原测定试剂盒和乙型肝炎病毒e抗原校准品。HBeAg定量检测结果以Paul Ehrlich institute单位(PEIU/mL)表示。

1.3 HBV DNA定量测定

取HBeAg定性检测为阳性的患者样本，采用美国Applied Biosystems公司的7500 Real Time PCR System和上海科华公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒。质控品来自上海市临床检验中心。HBV DNA阳性标准：HBV DNA>5×102Copy/mL。

1.4 统计学处理

HBeAg定量检测的性能验证数据采用EP Evaluation @软件(Release11)进行分析。HBeAg定量和定性检测、HBeAg定量和HBV DNA定量检测结果的分别比对，采用MedCalc(version 19.1)统计软件进行统计分析，利用配对T检验和Passing-Bablok回归分析比较两种方法检测结果的相关性。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBeAg定量检测的性能验证

精密度验证计算低值均值为1.335 PEIU/mL，批内精密度为2.7%，小于说明书宣称的5.25%，总精密度为5.2%，小于说明书中的7.04%，验证通过；精密度高值均值为99.387 PEIU/mL，高值批内精密度为1.5%，小于说明书的3.03%，总精密度为4.7%，小于说明书中的5.58%，验证也通过。灵敏度验证的数据经统计计算得灵敏度为0.014 PEIU/mL，小于厂商声明的0.02 PEIU/mL，验证通过。线性范围/可报告范围验证结果经统计分析，线性验证误差(error)为7.0%，小于线性可允许系统误差12.5%，且在检测的0～619.520 PEIU/mL范围内成线性，验证通过。携带污染率数据经统计评估为0.010，符合厂家声明和本院要求，验证通过。因此，经过验证，ARCHITECT HBeAg定量检测系统的精密度、分析灵敏度、线性范围、携带污染率均符合需求。

2.2 HBeAg定性和定量检测比对分析

性能验证显示HBeAg定量检测在0～619.520 PEIU/mL范围内成线性，因此选取HBeAg定量检测值在线性范围内的样本共618例来对比分析HBeAg定量和定性的检测结果。两种方法的检测结果均取Log10之后用对数值做统计分析。配对t检验显示HBeAg定量和定性检测方法的相关性良好(r=0.997，P<0.000 1)，如图1所示。Passing Bablok 回归分析的回归方程为y=-1.064+1.167x(r=0.997，P<0.000 1，95%CI=0.997～0.998)，显示相关性良好, 具体如图2所示。

图1 HBeAg定性和定量检测的相关性

图2 Passing Bablok 回归分析HBeAg定量和定性检测的一致性

2.3 HBeAg定量和HBV DNA的关系

选取126例同时定量检测了HBeAg和HBV DNA的样本，运用Passing and Bablok回归分析两种方法的相关性，回归方程为y=2.909+1.590x(r=0.363，P<0.000 1，95%CI=1.009～3.765)，显示HBeAg定量与HBV DNA定量检测水平呈明显的正相关，由表中统计可知，随着HBeAg定量水平的升高，处于高病毒载量的人群占比越来越高(见表2和图3)。

表2 HBeAg定量检测和HBV DNA定量检测的关系[n(%)]

图3 Passing-Bablok 回归分析HBeAg定量和HBV DNA定量检测的相关性

2.4 不同HBeAg定量水平与病毒学指标、血清生化学指标的关系

在98名有明确临床诊断的患者中选取有HBV DNA检验数据的57名患者，根据HBeAg定量水平分为 0.1～1.3 PEIU/mL，1.3～20 PEIU/mL，20～250 PEIU/mL，≥250 PEIU/mL 4组, 由表中数据统计可知，随着HBeAg定量检测值的逐渐升高，HBV DNA 病毒载量结果也相应增加。当HBeAg定量高于250 PEIU/ml时，可检测的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST异常率显著降低(92.31%降至50.00%)(见表3)。

表3 不同HBeAg定量水平下病毒学和血清生化学指标的特点

3 讨论

随着医疗研究的进展和医疗技术的不断进步, HBV血清学标志物的检测从定性检测进步到了定量检测[6-12]，定量检测使得一些乙肝血清学指标有了新的临床意义和应用，如HBsAg定量检测已经被纳入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，为乙肝诊疗个体化提供了新的依据[4]。近年来，关于HBeAg定量检测与慢性乙型肝炎治疗疗效的相关研究越来越多。一项关于接受干扰素治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的回顾性研究，对比了HBV DNA和HBeAg对于治疗后6个月HBeAg血清学转换的预测价值，发现：在干扰素治疗24周时，HBeAg、HBV DNA水平均可预测治疗后6个月的持久应答，且HBeAg比HBV DNA能更好地预测HBeAg的血清学转换；HBeAg水平在干扰素治疗24周处于低中值(<100 PEIU/mL)时，其预测价值和HBV DNA没有明显差别，但是水平处于高值(>100 PEIU/mL)时，HBeAg的预测值远高于HBV DNA(96% vs 86%)。这项研究结果表明血清HBeAg的定量检测可以用来补充或者部分替代HBV DNA作为HBeAg阳性乙肝患者干扰素治疗监控的指标[13]。慢性乙型肝炎患者治疗过程中的HBeAg定量水平变化，也是预测核苷(酸)类似物(nucleoside/nucleotide analogues, NAs) 治疗反应的有效工具。一项前瞻性研究纳入76例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者接受96周核苷(酸)类似物治疗，分别于治疗前、治疗后12周、24周定量监测血清HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)、 HBeAg、乙型肝炎核心抗体(hepatitis B core antibody, HBcAb)、HBV DNA和ALT的水平，结果显示治疗24周的HBeAg指标下降水平和幅度可用来预测病毒学应答和血清转换[14]。

HBeAg是诊断有无HBV感染和传染性的常用血清标志物。目前临床主要应用酶免疫法或化学发光法来检测HBeAg，判断阴阳性，用于辅助诊断HBV的感染状态[15-17]。HBeAg定性检测相较于定量检测具有检测快速、经济等优点，在筛查乙型肝炎患者中发挥了重要作用，但是在评估及预测HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者治疗疗效方面差于定量检测。近年来，随着免疫技术的发展和应用，HBeAg定量检测已经成为临床研究常用的指标。HBeAg和HBV DNA一起被纳入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，作为判断HBV治疗转归的标志。本实验室验证了雅培ARCHITECT i4000SR全自动免疫分析仪最新的HBeAg定量检测分析性能，验证结果表明HBeAg定量检测的精密度、分析灵敏度、线性范围、携带污染率均符合厂家说明书和本实验室的要求。通过对比慢性乙型肝炎患者HBeAg定性和定量两种检测方法的结果，发现这两种检测方法具有良好的相关性。本研究也验证了HBeAg定量检测结果和HBV DNA的检测结果呈正相关且当HBeAg定量≥250 PEIU/ml时，可检测的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST异常率显著降低(92.31%降至50.00%)。基于HBV DNA与HBeAg的定量检测结果的相关性，可由HBeAg定量结果对HBV DNA进行初步预测，并且当HBeAg≥250 PEIU/ml时，ALT或AST的异常率显著降低，ALT或者AST水平与肝脏的炎症活动密切相关，对临床诊断和治疗有一定的指导意义。综上所述，HBeAg可以用于实验室的常规检测来为临床乙型肝炎患者诊疗提供依据。