阴沟肠杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制

刘丽娟，王 学，姜梅杰，赵书平,任玉国

(1. 济南市人民医院检验科，山东 济南 271100； 2. 青岛市黄岛区西海岸新区人民医院检验科，山东 青岛 266500； 3. 泰安市中心医院检验科，山东 泰安 271000)

阴沟肠杆菌是医院内感染重要的病原菌，可引起呼吸道、伤口、泌尿系统感染和脑膜炎等病症[1-2]。碳青霉烯类抗生素是治疗此类菌株感染的最佳药物。但随着碳青霉烯类抗生素应用的增加，近年来临床上耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的检出数也逐年增加，给临床抗感染治疗带来困难[3-5]。对我院2019年4—9月检出的耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌分布、耐药性及耐药机制进行分析，为抗感染治疗及医院感染预防控制提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集本院2019年4—9月住院患者临床分离到的非重复耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(亚胺培南或美罗培南MIC≥2 mg/L)，所有菌株进行药敏试验。

1.2 细菌鉴定及药敏试验 采用WalkAway 96 PLUS NUC61复合板进行菌种鉴定及药物敏感性检测，用K-B纸片扩散法补充检测头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟、厄他培南、环丙沙星和左氧氟沙星的敏感性，药敏试验执行2018年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准。其中替加环素敏感性试验执行美国食品药品监督管理局(FDA)的标准，头孢哌酮/舒巴坦敏感性试验执行CLSI中头孢哌酮的标准。M-H琼脂和药敏纸片均为英国Oxoid产品。铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌株。

1.3 临床资料收集 采用回顾性分析方法，收集耐药菌感染患者的临床资料，包括标本来源、科室分布、基础疾病、抗菌药物应用、是否有创伤性操作、呼吸机的应用情况等。

1.4 碳青霉烯酶检测-改良碳青霉烯酶灭活试验 依据CLSI M100S-28th文件的改良碳青霉烯灭活试验mCIM联合eCIM试验筛选碳青霉烯酶产酶菌株。

1.5 碳青霉烯耐药基因检测及测序 煮沸法提取细菌DNA模板，采用多聚酶链反应(PCR)方法对碳青霉烯酶类相关耐药基因KPC、IMP、VIM、NDM、SME、IMI、NMC及OXA-23、OXA-24、OXA-48、OXA-51、OXA-58基因进行扩增测序，所用引物参考文献[6-10]报道。PCR反应体系为25 μL，含Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1 μL，dNTP mixture(5 mmol/L) 0.5 μL，待检菌DNA模板2 μL，引物F、R(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O补足至25 μL。退火温度参照文献[6-10]。PCR扩增产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果在GenBank中的BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行对比,确定基因型。

1.6 多位点序列分型(MLST) 对阴沟肠杆菌7个管家基因片段dnaA-fusA-gyrB-leuS-pyrG-rplB-rpoB通过PCR扩增后直接测序,测序结果在pubMLST数据库中已有管家基因谱进行比对，确定序列类型(ST)。MLST分析所用引物见表1。

表1 MLST引物序列

1.7 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 使用限制性内切酶XbaI对染色体DNA进行消化，试验参数为：14℃，电压6 V/cm，相对分子质量50～400 kb,电场夹角120℃,脉冲4～40 s，电泳时间20 h。溴化乙锭(EB)染色30 min后在紫外灯下观察结果，Bio-Rad凝胶成像系统成像，Bionumeric软件分析，作出进化树分析菌株亲缘性，各菌株间相似性>85%判断为同一克隆株。

1.8 统计分析 应用WHONET 5.6软件进行耐药性分析。

2 结果

2.1 临床资料 2019年4—9月共检出8株非重复耐碳青霉烯阴沟肠杆菌，5株来自于重症监护病房(ICU)；4株来源于痰,2株来源于穿刺液,1株来源于血标本,1株来源于尿标本。见表2。

表2 8例耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌感染患者临床资料

表3 抗菌药物对阴沟肠杆菌的MIC值及改良碳青霉烯酶灭活试验结果

A:0.5麦氏单位大肠埃希菌(ATCC 5922)标准菌液； B: MEM(10 μg)药敏质控片； C: mCIM阳性结果； D: eCIM阳性结果。

2.3 碳青霉烯类耐药基因检测及测序结果 8株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌均携带B类碳青霉烯酶，表型筛选和基因检测的符合率为100%。其中7株PCR扩增出NDM基因目标片段(见图2)，经测序分析比对均为NDM-1金属酶基因(见图3)；1株PCR扩增出IPM基因片段(见图4)，经测序分析为IPM-4金属酶基因(见图5)。

M:为DNA Marker；阴：为阴性对照；泳道1—4、6—8为临床blaNDM-1基因阳性菌株；泳道5为临床blaNDM-1基因阴性菌株。

图3 耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌PCR产物NDM-1金属酶基因测序图

M：为DNA Marker；阴：为阴性对照；泳道5为临床IPM-1基因阳性菌株；泳道1—4、6—8为临床IPM-1基因阴性菌株。

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析结果 8株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌MLST分子分型结果显示，有6个序列类型，依次为ST596(3株)、ST121(1株)、ST993(1株)、ST91(1株)、ST794(1株)、ST88(1株)，ST596是主要流行的序列类型，均来源于ICU。PFGE同源性分析共分为6个克隆群，分别为A群(菌株L1、L4、L8)、B群(菌株L6)、C群(菌株L2)、D群(菌株L7)、E群(菌株L5)、F群(菌株L3)。3株A群菌株均为ST596型，均来源于ICU。见图6。

图5 耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌PCR产物IPM-4金属酶基因测序图

图6 8株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌PFGE聚类分析

3 讨论

阴沟肠杆菌已成为医院感染的常见病原菌之一，其耐药机制十分复杂，可同时产Ampc酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及碳青霉烯酶，从而导致多重耐药，引起难治性感染。早期研究表明，产头孢菌素酶并伴有膜蛋白的缺失[11]是阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药主要原因。但是目前报道阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是产A类、B类或D类碳青霉烯酶[12]。

所有菌株mCIM联合eCIM碳青霉烯酶筛选试验结果与PCR结果一致，均检出B类碳青霉烯酶，7株为NDM-1金属酶基因，1株为IPM-4金属酶基因，说明产B类碳青霉烯酶NDM-1是该段时间内阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药的主要原因。 MLST分子分型及PFGE同源性分析有6个ST序列类型，6个克隆群：ST596(3株)均为A群，ST121(1株)为C群，ST993(1株)为F群，ST91(1株)为E群，ST794(1株)为B群，ST88(1株)为D群。其中3株ST596 A群阴沟肠杆菌均来源于ICU，说明5月初至8月底存在此型菌株的播散流行。警示本院感染监控部门应加强ICU多重耐药菌患者的管理，特别是要做好转入转出患者的监管，预防医院感染暴发。短时间内新生儿科出现2例多重耐药阴沟肠杆菌，虽然属于不同的克隆群，但也应分析原因，加强科室医院感染防控措施。

本研究显示，本院ICU存在ST596型A群耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的播散流行。主要的碳青霉烯类耐药机制是产B类金属酶，以NDM-1为主，呈现出多重耐药的趋势，且出现多粘菌素耐药菌株。由于研究标本时间跨度短，例数少，可能存在一定局限性，另本课题是回顾性研究，未对科室人员、医疗设备和周围环境等进行采样检测，未能查找到引起克隆聚集的感染源，需要进一步追踪研究。