抑癌基因PTEN、P27在子宫内膜癌及癌前病变中的表达及其临床意义*

李少星 余华 杨惠欢 刘战立

(1.成都医学院第一附属医院,四川 成都 610500;2.新津县人民医院,四川 成都 611430)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是临床常见生殖系统恶性肿瘤，其发病率正逐年上升，死亡率已超过宫颈癌，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%[1]。正常子宫内膜演变为EC是一个非常漫长的过程，而早发现、早治疗对于EC的防治意义重大[2]。多种癌基因及抑癌基因参与调控EC的发生发展过程[3]。既往研究显示，PTEN是抑癌基因，其高表达可明显抑制肿瘤细胞的增长，且PTEN是EC中突变率最高的基因[4]。P27是近年来发现的一种热稳定蛋白，可能是PTEN通过PI3K/AKT途径调节细胞分化增殖，诱导G1期阻滞过程的下游靶基因[5]。既往研究显示，在包含胃癌、乳腺癌、膀胱癌等在内的多种肿瘤组织及肿瘤细胞中可检测到PTEN及P27的异常表达，但是少见有关EC组织及癌前病变组织中PTEN及P27蛋白异常表达的相关报道[6-8]。因此，本研究采用免疫组织化学法对不同子宫内膜组织类型中PTEN及P27蛋白表达情况进行检测，旨在探讨抑癌基因PTEN及P27在EC及癌前病变中的诊断意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集2015年6月～2020年1月成都医学院第一附属医院确诊为EC患者的存档癌组织蜡块35例，同时选取同期存档的39例内膜增生过长(不伴不典型)、26例子宫内膜不典型增生和35例正常子宫内膜组织蜡块。按组织类型不同分为正常子宫内膜组、内膜增生过长组、子宫内膜不典型增生组和EC组。EC组按病理分级分：G1 14例，G2 16例，G3 5例；临床分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期9例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例；肌层浸润：无肌层浸润12例，浸润≤1/2肌层16例，浸润>1/2肌层7例；淋巴转移：无淋巴转移29例，盆腔淋巴结转移4例，腹主动脉旁淋巴结转移2例；组织学类型：Ⅰ型(子宫内膜样腺癌)27例，Ⅱ型8例(浆液性乳头状腺癌6例，透明细胞癌2例)。所有组织类型均经病理结果证实，所有患者术前均未接受过化疗或放疗，各组患者之间年龄、身体状况无明显差异，具有可比性。

1.2 实验试剂及仪器 SP试剂盒、PTEN及P27一抗均购于北京中杉金桥公司，光学显微镜购于德国徕卡公司。

1.3 免疫组织化学法检测组织PTEN及P27表达 将收集的各组织蜡块进行石蜡切片，厚度约为4 μm，经常规脱蜡、脱水，抗原热修复，去离子水孵育，滴加PTEN及P27一抗，置于4 ℃过夜后采用PBS清洗2次，滴加聚合酶辅助剂，37 ℃水浴持续孵育20 min；PBS冲洗2次，滴加IgG多聚体；37 ℃水浴孵育30 min；采用DBA溶液显色。阴性对照为未加一抗的PBS缓冲液，阳性对照为正常的子宫内膜组织切片，每批染色均设置阴性和阳性对照。

1.4 结果判断 将切片置于光学显微镜下，随机选取5个高倍视野，统计各视野阳性细胞数。PTEN及P27的阳性表达细胞核、细胞浆染成棕黄色。阳性细胞数<10%为阴性(-)；阳性细胞数10%～50%为弱阳性(+)；阳性细胞数>50%为强阳性(++)。

2 结果

2.1 各组患者一般资料比较 4组患者年龄、BMI及合并症比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 4组患者一般资料比较

2.2 不同组织中PTEN表达情况比较 免疫组织化学结果显示，PTEN在正常子宫内膜中的阳性率为100%，而在内膜增生过长组和内膜不典型增生组中PTEN阳性率分别降低为79.49%和69.23%。EC组PTEN阳性率为42.86%，显著低于其他组(2=28.000，P<0.001；2=10.523，P=0.001；2=4.179，P=0.041)，见表2、图1。

表2 不同组织中PTEN表达情况比较

2.3 不同组织中P27表达情况比较 不同内膜组织中P27阳性表达存在显著性差异(P<0.05)。正常子宫内膜和内膜增生过长中P27阳性表达率较高，在内膜不典型增生和EC组中P27阳性表达率较低。EC组P27阳性表达率显著低于正常子宫内膜及内膜增生过长组(2=30.688，P<0.001；2=21.941，P<0.001)，见表3、图1。

图1 不同子宫内膜组织中PTEN及P27表达情况(免疫组化，100×)

表3 不同组织中P27表达情况比较

2.4 EC组织中PTEN及P27的阳性表达与病理参数的关系 随着EC病理分级升高，其PTEN及P27阳性率显著降低(P<0.05)；内膜样癌组织中PTEN及P27阳性率明显低于非内膜样癌组织(P<0.05)。EC临床分期、肌层浸润和有无淋巴结转移对EC中PTEN及P27的阳性表达无明显影响(P>0.05)，见表4。

表4 EC组织中PTEN及P27的阳性表达与病理参数的关系[n(×10-2)]

2.5 子宫内膜不典型增生中PTEN及P27蛋白表达相关性 子宫内膜不典型增生组织中，PTEN及P27蛋白共同阳性表达10例，共同阴性表达7例，子宫内膜不典型增生组织中PTEN及P27蛋白表达正相关(r=0.402，P=0.042)，见表5。

表5 PTEN及P27蛋白在子宫内膜不典型增生中表达相关性(n)

2.6 EC组织中PTEN及P27蛋白表达相关性 EC组织中，PTEN及P27蛋白共同阳性表达11例，共同阴性表达19例，EC组织中PTEN及P27蛋白表达正相关(r=0.712，P<0.001)，见表6。

表6 EC组织中PTEN及P27蛋白表达相关性(n)

3 讨论

近年来，EC及癌前病变的发生率不断上升，且日益年轻化，而早诊断早治疗是提升EC防治效果的关键[9-10]。肿瘤疾病的发生是一个逐渐演变的过程，EC的发生也经历了一系列过程，包含子宫内膜细胞的异常增殖、瘤变及EC的形成，而周期调控机制异常是这一过程的内在原因[11]。机体内癌细胞的周期调控是由多种因素共同介导的，其中PTEN及P27等周期相关蛋白参与子宫内膜细胞的调控过程，与EC的发生与发展密切相关[12-13]。子宫内膜增生过长及内膜不典型增生均是子宫内膜癌前病变的过程，基于此，本研究通过分析正常子宫内膜、子宫内膜增生过长、内膜不典型增生及EC四种不同组织中PTEN、P27的表达情况，分析其与EC发生及发展过程的关系，旨在为临床EC的诊疗提供理论参考。

PTEN，又称为MMACI基因，由9个外显子组成，主要是通过PIP3脱磷酸降低细胞内的PIP3水平，进而阻断Akt-蛋白激酶B(PKB)途径，影响其下游通路，包括通过抑制基因P27、BAD等的磷酸化水平将细胞周期阻断在G1期，进而显著抑制细胞增殖，并诱导凋亡的发生[14]。此外，PTEN还能使局部粘附激酶(foca 1 adhesion kinase，FAK)脱磷酸，进而影响细胞增殖及浸润介导的细胞铺展及局部粘附的形成[15]。祁晓莉等[16]研究显示，采用免疫组织化学染色可观察到PTEN在EC中的阳性表达率明显低于其他子宫内膜组织。而本研究结果显示，在正常子宫内膜、内膜增生过长、内膜不典型增生及EC组织中PTEN阳性表达率分别为100.00%、79.49%、69.23%和42.86%，PTEN在癌及内膜不典型增生中的表达缺失与内膜增生过长及正常子宫内膜组织相比，具有显著性差异，说明PTEN表达被抑制或缺失则可能会使子宫内膜生长失控，导致癌变的发生。Black等[17]证实PTEN在基因水平的改变与EC的发生和发展显著相关。在本研究中，PETN的阳性表达率与病理分级明显相关，组织病理分级越高其阳性表达率越低，提示肿瘤恶性程度越高，PTEN蛋白表达量越低，其对应的预后越差，其在非内膜样癌组织中阳性表达率明显低于内膜样癌组织也进一步证实这一观点，而这一结论对于临床评估子宫内膜癌患者预后意义重大。但本研究结果显示，EC组织中PTEN蛋白阳性表达率随着肌层浸润深度加深、临床分期升高及出现淋巴结转移而降低，但差异并无统计学意义，这可能与本研究样本量较少有关。由于肌层浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况均是影响EC患者预后的重要因素，对于其预后的判断至关重要，因此在后续的研究中仍需进一步扩大样本量，进一步分析PTEN与EC发生发展过程的关系。

P27定位于染色体12pI3，属于CDKI中KIP/CIP家族中的一员，其与cyclinE-CDK2复合物结合，能有效抑制cyclinE-CDK2复合物活性，而高浓度cyclinE-CDK2是细胞通过G1到S限制点最关键的因素[18]。此外，P27是潜在的肿瘤抑制基因，P27的下调和CDK2的激活都能诱导细胞恶变，形成肿瘤细胞，保持机体内P27正常浓度是抵抗细胞恶变的基础[19]。本研究发现，正常子宫内膜、内膜增生过长、内膜不典型增生及EC组织中P27阳性表达率分别为97.14%、87.18%、42.31%和34.29%，提示P27表达的缺失是诱发EC及癌前病变的关键因素之一，与杨玉敏等[20]研究结果一致。P27蛋白在病理分级G1、G2及G3组织中阳性表达率分别为64.29%、18.75%及0.00%，三者间具有显著性差异，且其在内膜样癌组织中的阳性表达率明显低于非内膜样癌组织，提示P27可能介导EC的演变过程，对P27进行检测可为早期诊断EC和临床综合治疗提供参考。本研究证实在EC系列病变中，P27呈现逐渐下降趋势，提示P27表达下降可能在子宫内膜细胞病变中起着重要作用，为子宫内膜癌变的早期信号。此外，在EC及癌前病变组织中PTEN与P27间存在正相关关系，其原因可能在于PTEN表达缺失会导致P27表达异常，从而导致细胞周期失控，诱导EC的发生。因此，采用免疫组织化学法联合检测PTEN、P27有助于EC以及癌前病变的早期诊断。

4 结论

由PTEN及P27基因突变和缺失导致的PTEN、P27功能丧失是EC发生的早期事件，在子宫内膜不典型增生组织及EC组织中PTEN与P27蛋白表达量呈正相关，两者共同作用介导子宫内膜过度增生发展至EC的过程，采用免疫组织化学法检测PTEN及P27基因有助于鉴别EC及癌前病变，且对EC的癌变程度具有一定的评估作用。