红毛藻复合脱腥工艺的优化及其挥发性成分GC-MS分析

徐玉雪，陈艳红，2，3，陈昭华，杜希萍，2，3*，姜泽东，2，3，倪辉，2，3，李清彪，2，3

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

红毛藻（Bangia fusco-purpurea），又称红毛菜、红发菜，属红藻门，是一种可食用的珍贵海洋红藻，含有丰富的脂肪、蛋白质和各类氨基酸，具有提高免疫力、降血压、降血脂和防止动脉粥状硬化等心血管疾病的食、药用功效[1-3]。近年来，随着人民生活水平的提高，红毛藻的养殖及加工受到了越来越多的关注，其中福建省莆田市红毛藻被认定为国家地理标志产品[4]。但由于红毛藻具有强烈的腥味，影响食品风味及其在终端产品中的应用。而目前尚缺少有效的红毛藻脱腥技术，限制了其深加工产品的开发。

相关研究报道可以采用物理法、化学法、生物法和复合法对食品进行脱腥[5]。其中，物理脱腥法中的加热脱腥是利用高温使异味物质挥发，从而达到脱腥效果[6]。化学脱腥法中采用溶剂浸泡可以去除腥味，其中有机酸可以消除组胺、螯合金属离子，有助于减少腥味物质的产生[7]，常用脱腥的可食用酸有醋酸、柠檬酸、苹果酸等。然而，单一脱腥技术都有其适用范围和局限性，而采用两种或两种以上脱腥技术，利用各方法之间的互补和协同增效作用，可达到更好的脱腥效果。因此，通常会采用多种方法的对比和联合使用，以确定最佳的工艺。尹宗美等发现复配蓝莓酵素-薄荷提取物脱腥剂对裙带梗的脱腥效果最佳，将蓝莓酵素与薄荷提取物复配（30∶1的质量比），脱腥剂溶液的固形物含量2%，最佳脱腥条件为脱腥剂溶液与裙带梗的质量比12∶1，脱腥时间3 h，脱腥温度30℃[8]。张淼等用CaCl2和绿茶质量比为1∶1的复合脱腥剂对银鳕鱼进行脱腥，结果表明复合脱腥剂浓度2.75%、浸泡料液比 1∶11（g/mL），浸泡时间 48 min、浸泡温度 38.3 ℃时，银鳕鱼脱腥效果最优[9]。不同的食品由于原料特性及腥味成分的差异，脱腥的工艺并不完全相同。

分析检测腥味的方法主要有感官评价及仪器分析两种方法。其中，感官检验是借助人的嗅觉器官感知腥味的强度[10]，是最直接的宏观评价方法。仪器分析方法中，顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 具有操作时间短、分离能力高、鉴定准确度高等优点[11]。

本文以国家地理标志产品福建莆田红毛藻为研究对象，采用复合法加热联合浸泡脱腥剂对红毛藻脱腥，应用正交试验优化脱腥工艺，并使用感官评价结合GC-MS检测分析脱腥前后红毛藻挥发性成分的变化，为红毛藻产品加工和延伸制品的推广提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红毛藻：福建省莆田市南日岛；柠檬酸、冰醋酸、无水碳酸钠、乙醇：国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

QP-2010 Plus气相色谱质谱串联仪、Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱：日本岛津公司；BC/BD-318A冰箱：青岛海尔特种冰柜有限公司；BS233S电子天平：德国赛多利斯科学仪器厂；ZXRD-85110定温恒温干燥箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 材料的处理

将红毛藻置于15倍～20倍体积的清水中，浸泡1 h后，清水洗至红毛藻表面无泥沙等杂质，捞出沥干后放置于烘箱，40℃烘干备用。

1.4 复合法脱腥工艺的单因素优化

1.4.1 加热温度的优化

将红毛藻放置在不同温度（30、50、70、90、110 ℃）的烘箱处理1 h，分别称取加热处理后红毛藻0.1 g，加入30 mL蒸馏水，60℃水浴30 min，以红毛藻腥味强度为指标，进行感官评分，研究加热温度对红毛藻脱腥效果的影响，每组样品处理设3次平行。

1.4.2 加热时间的优化

在最优加热温度的条件下，将红毛藻放置于烘箱分别处理 1、2、3、4、5 h，称取加热处理后红毛藻 0.1 g，分别加入30 mL蒸馏水，60℃水浴30 min，以红毛藻腥味强度为指标，进行感官评价，研究加热时间对红毛藻脱腥效果的影响，每组样品处理设3次平行。

1.4.3 浸泡脱腥剂种类的优化

参考相关脱腥文献[12-13]，选取5%柠檬酸溶液、5%乙醇溶液、5%碳酸钠溶液和5%醋酸溶液为浸泡脱腥剂。将红毛藻置于烧杯中，分别加入等量的水和不同浸泡脱腥剂，处理30 min，洗净烘干；分别称取浸泡处理后的红毛藻0.1 g，加入30 mL蒸馏水，60℃水浴30 min，以红毛藻腥味强度为指标，进行感官评价，研究浸泡脱腥剂种类对红毛藻脱腥效果的影响，每组样品处理设3次平行。

1.4.4 浸泡脱腥剂浓度的优化

在最优加热温度、加热时间及浸泡脱腥剂的条件下，将红毛藻分别置于等量、浓度为1%、3%、5%、7%、9%的浸泡脱腥剂中，处理30 min，洗净烘干；分别称取浸泡处理后的红毛藻0.1 g，加入30 mL蒸馏水，60℃水浴30 min，以红毛藻腥味强度为指标，进行感官评价，研究浸泡脱腥剂浓度对红毛藻脱腥效果的影响，每组样品处理设3次平行。

1.4.5 浸泡脱腥剂处理时间的优化

在最优加热温度、加热时间及浸泡脱腥剂的条件下，将红毛藻置于最优浓度的浸泡脱腥剂，分别处理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，洗净烘干；分别称取浸泡处理后的红毛藻0.1 g，加入30 mL蒸馏水，60℃水浴30 min，以红毛藻腥味强度为指标，进行感官评价，研究浸泡脱腥剂处理时间对红毛藻脱腥效果的影响，每组样品处理设3次平行。

1.5 复合脱腥正交试验优化

在单因素试验结果的基础上，选取加热温度（A）、加热时间（B）、醋酸浓度（C）和处理时间（D）4个因素，采用四因素三水平的正交试验分析方法，以红毛藻复合脱腥感官评分结果为指标，优选出红毛藻复合脱腥的最优工艺参数，正交试验的因素和水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal experimental design

1.6 分析方法

1.6.1 红毛藻腥味强度的评价

根据文献[14-15]并稍作修改，召集10名（5男5女，23岁～30岁）具有食品感官评定经验的人员组成评定小组。评分标准为：基本无腥味，1分～3分；腥味一般，4分～6分；腥味重，7分～9分；腥味很重难以接受，10分。评定结果以10名评价员打分的平均值表示。

1.6.2 红毛藻挥发性成分分析

样品制备：取30 mL超纯水于50 mL萃取瓶中，加入1 g复合脱腥后的红毛藻，再加入10 μL 1 mg/mL的环己酮作为内标物，拧紧瓶盖，摇匀，置于60℃恒温水浴锅中平衡30 min。采用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取头吸附30 min，进行GC-MS分析。每组样品处理设3次平行。未经复合脱腥红毛藻作为空白对照，处理同上。

色谱条件为色谱柱：Rtx-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：进样口温度为 230℃；最初温度为50℃并保持5min，以3℃/min升温至200℃，在200℃保持1 min。用高纯氦气（纯度99.999%）作为载气，柱流量为3 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度为250℃；扫描方式选择SCAN模式进行定性分析；质量扫描范围m/z 35～500。溶剂延迟时间为3 min。

定性定量分析：运用质谱数据库（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）进行相似度检索，根据不同物质的基峰、质荷比和相对峰度做串连检索与人工解析，质谱匹配度大于80%作为物质鉴定标准；计算待测组分的保留指数，与文献报道的保留指数进行对比定性。

式中：RIx为待测定成分的保留指数；t（i）为待测成分的调整保留时间，min；t（n）为具有n个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，min；t（n+1）为具有n+1个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，min。

此外，采用内标法进行定量，按公式（2）进行计算。

1.7 数据统计分析

通过Microsoft Office Excel 2010软件与SPSS软件计算试验数据的均值和标准差并进行显著性分析（Duncan检验，p＜0.05），并绘柱状图。通过正交试验设计（orthogonal experimental design）软件进行正交试验的设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 加热温度对红毛藻脱腥效果的影响

加热温度对红毛藻脱腥效果的影响见图1。

图1 加热温度对红毛藻脱腥效果的影响Fig.1 Effect of heating temperature on the fishy odor of B.fuscopurpurea

如图1所示，在30℃～90℃范围内，随着温度升高腥味感官评分逐渐降低，并存在显著性差异；90℃～110℃范围内，随着温度升高腥味感官评分稍有下降但无显著性差异，原因可能是加热温度超过一定界限继续升高时，红毛藻中挥发性气体成分的浓度及种类开始增大，减弱了温度对红毛藻腥味的影响。王琳等[16]研究表明，随着加热温度增加，螺旋藻腥味越来越淡，当温度大于60℃时，脱腥变化趋于平稳，本试验结果与其具有相似性。此外，由于温度高于70℃时，红毛藻的颜色逐渐变浅，表明红毛藻色素可能被破坏，因此选择70℃为红毛藻最佳脱腥温度。

2.2 加热时间对红毛藻脱腥效果的影响

加热时间对红毛藻脱腥效果的影响见图2。

图2 加热时间对红毛藻脱腥效果的影响Fig.2 Effect of heating time on the fishy odor of B.fusco-purpurea

由图2可知，在加热时间1 h～4 h范围内，随着时间延长，腥味感官评分从8分降到5分，并存在显著性差异；4 h～5 h范围内，随着时间增加腥味感官评分稍有下降但无显著性差异。阳晖等[17]利用加热法对螺旋藻脱腥，发现加热时间变化对脱腥效果影响较小，随着时间延长其颜色会发生变化。而本研究结果表明加热时间对红毛藻腥味具有一定的影响，综合考虑脱腥效果和节省时间，选择4 h为最佳加热时间。

2.3 浸泡脱腥剂对红毛藻脱腥效果的影响

浸泡脱腥剂对红毛藻脱腥效果的影响见图3。

图3 浸泡脱腥剂对红毛藻脱腥效果的影响Fig.3 Effect of soaking deodorant on the fishy odor of B.fuscopurpurea

从图3可以看出，通过浸泡脱腥剂处理红毛藻后，各种脱腥剂对红毛藻有显著脱腥效果，其中乙醇与醋酸脱腥效果最好。俞静芬等[12]用5%柠檬酸和5%醋酸分别处理海带60 min，醋酸脱腥效果优于柠檬酸。江洁等[13]研究发现酸法和乙醇脱腥效果相当，碱法效果最差。本研究结果与以上学者研究的脱腥规律具有相似性。此外，由于乙醇和碳酸钠处理会引起红毛藻颜色发生变化，因此选择醋酸为最优的浸泡脱腥剂。

2.4 醋酸浓度对红毛藻脱腥效果的影响

醋酸浓度对红毛藻脱腥效果的影响见图4。

图4 醋酸浓度对红毛藻脱腥效果的影响Fig.4 Effect of acetic acid concentration on the fishy odor of B.fusco-purpurea

由图4可知，在1%～9%浓度的范围内，随醋酸浓度的增加，红毛藻腥味逐渐降低；其中3%与5%浓度的醋酸处理红毛藻，其感官评分无显著性差异；7%与9%浓度的醋酸处理红毛藻，其感官评分无显著性差异。由于随着醋酸浓度增加，其酸味逐渐增强，故选择3%为最佳醋酸浓度。

2.5 醋酸处理时间对红毛藻脱腥效果的影响

醋酸处理时间对红毛藻脱腥效果的影响见图5。

图5 醋酸处理时间对红毛藻脱腥效果的影响Fig.5 Effect of acetic acid treatment time on the fishy odor of B.fusco-purpurea

如图5所示，随着醋酸处理时间的增加，其感官评分逐渐降低，其中处理时间为2.0 h～2.5 h时，感官评分虽有降低但无显著性差异，从节省时间考虑，选择2.0 h为最优处理时间。

2.6 红毛藻复合脱腥正交试验优化

运用正交试验法研究红毛藻复合脱腥的最优工艺，试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可以看出，各因素对提取率影响大小次序为：D＞A＞B＞C，即醋酸处理时间＞加热温度＞加热时间＞醋酸浓度。根据k值最优组合为A3B3C1D2和A3B2C1D2，即加热温度90℃，加热时间4 h（或3h），醋酸浓度3%，醋酸处理时间2.0h，正交试验最优组合为A2B3C1D2，此时感官评分最低为1.5，由于加热后红毛藻的颜色变浅，表明红毛藻色素被破坏，故不选择加热温度90℃。故选择A2B3C1D2为最优脱腥工艺。

2.7 红毛藻复合脱腥前后挥发性成分的对比

选择最优脱腥工艺处理的样品和未处理样品进行红毛藻脱腥前后挥发性成分的对比，红毛藻复合脱腥前后挥发性物质的总离子流结果如图6所示。

图6 复合脱腥红毛藻前后总离子流图Fig.6 Total ion chromatogram（TIC）of the volatiles in the B.fusco-purpurea before and after compound deodorization

未经复合脱腥红毛藻样品中共鉴定出7大类46种挥发性成分，其中醇类4种，烯烃7种，醛类12种，酮类13种，酯类2种，烷烃类3种和其它类5种；复合脱腥红毛藻样品中共鉴定出6大类26种挥发性成分，其中醛类8种，酮类2种，烷烃类7种，烯烃类2种，酯类1种，其它类6种。相关研究报道，烷烃类化合物的气味阈值较高，对藻类腥味贡献不大；醛类、醇类化合物气味阈值一般较低，通常会产生一些令人不愉快、辛辣的刺激性气味，其中庚醛、2，4-庚二烯醛、2-辛烯醛、2，4-辛二烯醛、2，4-癸二烯醛、壬醛、2-壬烯醛、2，4-辛二烯、1-辛烯-3-醇、3，5-辛二烯-2-酮等是腥味的主要贡献者[18-22]。部分化合物由于含量少，无法确定其化学结构，部分为色谱柱成分流失产生的杂峰，将这些成分扣除后，依据相似度检索、特征离子碎片分析以及参照相关文献，对挥发性成分进行定性定量，结果如表3所示。

表3 红毛藻复合脱腥挥发性成分定性定量表Table 3 Identification and content of the volatiles of the B.fusco-purpurea compound deodorization

续表3 红毛藻复合脱腥挥发性成分定性定量表Continue table 3 Identification and content of the volatiles of the B.fusco-purpurea compound deodorization

由表3可知，红毛藻空白对照样品的挥发性成分中，醇类主要有 1-辛烯-3-醇（88.38 μg/g）、2-癸烯-1-醇（55.81 μg/g），醛类主要有壬醛（44.40 μg/g）、癸醛（2.81 μg/g）、2-壬烯醛 （0.96 μg/g）、2，4-癸二烯醛（0.23 μg/g），酮类主要有 3，5-辛二烯-2-酮（2.53 μg/g）。其中挥发性成分1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮为文献[18-22]报道的腥味成分，是造成红毛藻腥味主要物质。

红毛藻经过复合脱腥后，其挥发性成分由46种变为26种，醇类、醛类和酮类物质明显减少，烷烃类和其它类物质明显增多，其中腥味成分1-辛烯-3-醇、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛、3，5-辛二烯-2-酮的含量降为 0，壬醛由44.40 μg/g降为37.89 μg/g，是造成红毛藻腥味下降的主要原因。β-紫罗兰酮由44.52 μg/g增为88.89 μg/g，β-环柠檬醛由 3.00 μg/g 增为 9.42 μg/g，其中α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮主要呈木香和花香等，β-环柠檬醛主要呈薄荷香、果香等[23]，对脱腥后的红毛藻气味具有一定的贡献。顾赛麒等[24]研究发现，海带脱腥后醛类、酮类、醇类等挥发性成分有效降低，庚醛、辛醛和癸醛等直链醛的浓度发生了显著下降，1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇脱除率分别为25.87%和100%，脱腥效果明显。本研究发现复合脱腥后红毛藻的主要腥味成分消失，与顾赛麒等研究结果一致。

3 结论

本文采用加热联用浸泡脱腥剂对红毛藻脱腥，结果发现复合脱腥可显著降低红毛藻的腥味，最优脱腥工艺为加热温度70℃，加热时间4 h，醋酸浓度3%，醋酸处理时间2.0 h。GC-MS分析红毛藻脱腥前后挥发性成分，结果表明，脱腥前红毛藻含有醇类、烯烃、醛类、酮类、酯类、烷烃类和其它类共7大类46种挥发性成分，其中 1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮为腥味成分；复合脱腥后，挥发性成分由46种变为26种，醇类、醛类和酮类物质明显减少，腥味成分 1-辛烯-3-醇、壬醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛和3，5-辛二烯-2-酮降为0，壬醛由44.40 μg/g降为37.89 μg/g。本研究结果为红毛藻的精深加工提供了技术支持。