锦香草及其近缘种的亲缘关系ITS序列分析

陆彭城，张文春，陈建芳，黄学敏，叶 菁，彭东辉，*

(1.福建农林大学，福建 福州 350000； 2.龙岩新罗区林业局，福建 龙岩 364000； 3.泉州永春县林业局，福建 泉州 362000； 4.福州植物园，福建 福州 350000)

锦香草属(Phyllagathis)是野牡丹科(Melastomataceae)蜂斗草族(Sonerileae)旧世界热带的一个大属。中国的锦香草属有28种，5变种，主要分布于四川、贵州、江西、福建、湖南等省。锦香草(Phyllagathiscavaleriei)及其近缘种用途广泛，为民间常用的中草药，具止血、止痛、祛瘀等功效，极具药用价值；此外，锦香草还是优良的乡土植物，具有很高的观赏价值[1-2]。

锦香草属自成立以来，关于该属的分类关系争议不断，尤其是关于我国的类群，分类关系反复修改，仍不完善[3]。其中，锦香草种内分类关系混乱，与其近缘种短毛熊巴掌(P.cavalerieivar.tankahkeei)、长柄熊巴掌(P.cavalerieivar.wilsoniana)和猫耳朵(P.wenshanensis)界定模糊，《Flora of China》[4]将《中国植物志》[1]中锦香草3个近缘种种名归并为锦香草异名，该做法有待进一步探讨。前人关于锦香草及其近缘种的分类学研究存在所取样品数量有限、所采用的分子标记方法提供的有效信息位点有限、未获得令人信服的支持率等问题[5-9]。内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列是分子标记片段常用的有核基因组标记，不仅适用于探讨属间、种间，以及种下水平等较低分类阶元的系统分类，也适用于研究种群间、野生种和栽培种之间的亲缘关系[6]。因此，本文利用ITS序列对锦香草及其近缘种植物进行全面细致的分类学研究，以期更好地开发利用锦香草种质资源，为杂交育种提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

2017—2019年，多次分时段在浙江、福建、江西、广东、广西、湖南等地开展野生种资源调查时采集锦香草材料，并进行实地拍照、调查记录各样品的野外生境与生长状况(图1)。在不滥采、不破坏生态环境的前提下，少量采集样品并引种于福建农林大学(26°05′20″N， 119°13′45″E)兰苑温室种植。本研究共选取46份材料，包括37份锦香草属植物及其近缘种，以及9份野牡丹科植物(包含8个属的模式种，部分序列从GenBank下载)，其中异药花(Fordiophytonfaberi)、偏瓣花(Plagiopetalumesquirolii)、柏拉木(Blastuscochinchinensis)、野海棠(Brediahirsute)和红敷地发(Phyllagathiselattandra)作为ITS外类群。具体植物材料样品的学名、来源、GenBank登录号见表1。

表1 样品的基本信息

1.2 DNA提取

提取无病害幼嫩叶片的DNA，取样前先用蒸馏水洗净叶片表面，装入自封袋中并做好标记带回实验室。参照何雪娇等[7]改良的CTAB法提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 ITS序列扩增与测序

PCR反应体系5 μL：在DNA模板中加入引物(4×10-12mol)、10×测序缓冲液4 μL，最后加DNA测序试剂至总体积为5 μL。引物序列ITS-17SE：5′-ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG-3′；ITS-26SE：5′-GAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3′[8]。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃延伸8 min。待反应结束后取3 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后的DNA条带送至福州博尚生物技术有限公司测序。

1.4 数据处理

先将序列峰图文件(.ab1)用SeqMan5.0软件手动进行校对和拼接，以获得质量较高的ITS序列；再将序列复制到Notepad++软件中保存为fasta文件(.fasta)，用MEGA5软件中的Muscle对拼接好的序列进行比对，同时适当地手动调整序列首尾两侧，当两侧碱基不足时以“？”补足；将ITS数据集合并成矩阵进行序列长度和GC含量分析，并以Kimura 2参数计算遗传距离。最后将ITS数据集合并成矩阵进行系统发育分析，并另存为fasta文件(.fasta)备份数据。在CIPRES Science Gateway网站上使用最大似然法(maximum likelihood，ML)，设置1 000次重复的自展分析和GTRGAMMA模型来评估系统树拓扑结构的可靠性。最后用Adobe Illustrator CS6和Adobe Photoshop CS6软件对系统发育树进行后续的编辑和美化。

A1、A2，锦香草；B1、B2，短毛熊巴掌；C1、C2，长柄熊巴掌。A1 and A2， P. cavaleriei; B1 and B2， P. cavaleriei var. tankahkeei; C1 and C2， P. cavaleriei var. wilsoniana.图1 锦香草及其近缘种的花与叶片Fig.1 Flowers and leaves of P. cavaleriei and its related species

续表1 Continued Table 1

续表1 Continued Table 1

2 结果与分析

2.1 ITS序列比较

对所有测序材料进行ITS序列比对分析：序列长度为717～783 bp，总GC含量为58.6%～61.2%，高于AT含量，表明该序列对GC碱基具有偏向性。保守位点(conserved site)582个，占总位点数的72.21%；变异位点(variable site)共202个，占25.06%；信息位点(parsim-info site)84个，占10.42%。其中，锦香草、短毛熊巴掌与长柄熊巴掌的5.8S序列长度较为一致，为160～161 bp，其中GC含量为53.1%～53.4%，保守位点65个，变异位点数96个，信息位点仅有10个(表2)。与5.8S序列相比，ITS序列的变异更加丰富，ITS1序列长度为246 bp，GC含量为63.4%～65.8%，有保守位点18个，占总数的8.37%；变异位点达229个，占91.23%；信息位点145个，占比57.77%。ITS2的序列长度为230 bp，GC含量为62.6%～66.5%，保守位点34个，占总位点数的14.22%；变异位点共有197个，占比82.43%；信息位点87个，占36.4%。

表2 供试样本ITS序列长度和GC含量Table 2 Length and GC content of ITS sequence of samples

2.2 遗传距离与ITS系统树分析

基于K2P模型对实验材料进行遗传距离分析，结果(表3)表明，锦香草与短毛熊巴掌遗传距离较小，平均仅为0.008，亲缘关系近；而与长柄熊巴掌遗传距离较大，平均遗传距离达0.039，最远为来自四川的长柄熊巴掌与贵州的短毛熊巴掌，距离为0.044。长柄熊巴掌与不同来源地锦香草、短毛熊巴掌的最小遗传距离的值均大于锦香草与短毛熊巴掌的最大遗传距离。

表3 ITS片段的遗传距离Table 3 Genetic distance of ITS sequences

基于ITS序列进行ML树构建，结果(图2)显示，37份锦香草及其近缘种植物分为2个Clade，构成姐妹支(BSML=71)。其中Clade 1(BSML=100)共包括34个样品，由所有锦香草和短毛熊巴掌互相穿插嵌套构成，各个地区的锦香草和短毛熊巴掌交叉聚在一起，表明各地域锦香草和短毛熊巴掌亲缘关系较近；3份长柄熊巴掌单独聚成Clade 2(BSML=100)，与锦香草属模式种圆叶锦香草(P.rotundifoliaMG644436.1)、长穗花(StyrophytoncaudatumMG644474.1)、光萼八蕊花(Sporoxeialatifoliavar.fengii376)和药囊花(Cyphothecamontana361)构成姐妹支。

图2 基于ITS序列的锦香草及其近缘种的ML树Fig.2 Phylogenetic relationships of P.cavaleriei and its related species based on ITS sequences

3 结论与讨论

ITS序列的进化速率较快，在植物属间和种间具有较多的变异位点和信息位点，是用来探讨植物种内、种间，以及近缘种间变异的有效分子手段之一[10-11]。遗传距离是种间基因差异程度的数值度量方式，常用遗传系统树加以表达。本研究中利用ITS序列进行系统发育分析发现，长柄熊巴掌与锦香草、短毛熊巴掌的最小遗传距离大于锦香草与短毛熊巴掌之间的最大遗传距离，因此，通过三者遗传距离的比较可以区分出长柄熊巴掌，长柄熊巴掌与另外二者之间存在较大的基因差异。这一点在进化树中更为直观，长柄熊巴掌单独聚为一支，亲缘关系较远，锦香草与短毛熊巴掌聚为同一进化分支且相互交叉显示出极近的亲缘关系。以上结果表明，ITS序列能够在分子水平上将长柄熊巴掌单独分类鉴定出来，锦香草与短毛熊巴掌相互交叉难以鉴定，这在分子水平上为锦香草与短毛熊巴掌同种异名提供了证据。结合ITS数据的鉴定结果，支持锦香草和短毛熊巴掌为同种异名，长柄熊巴掌为独立进化支。

锦香草和短毛熊巴掌均有按来源地聚类的趋势但并不完全一致。在短毛熊巴掌中湖南舜皇山(HNSHS018、HNSHS025)、广西(GXSTS035、GXYSGY036)和福建(FJGYS039、FJJDS097)的样品嵌入不同来源地的锦香草中，其余短毛熊巴掌样品都聚在了一起，并有按地域聚类的趋势；锦香草聚类结果的地域性更强，在锦香草分布中，先是贵州小丹江样品按地域来源聚在一起，广西金秀和圣堂山样品聚在一起，来自广东石门台和丹霞山的样品聚在一起；然后，贵州雷公山全部样品也按地域来源聚在一起，接着广西(桂平、金秀、玉林和莲花山)、湖南舜皇山和广东南岭聚在一起。大部分锦香草有按地域聚类的趋势，小部分如江西齐云山(JXQYS 100)和湖南永州(HNYZ 098)嵌套在了福建吉当山的短毛熊巴掌、广西和贵州的锦香草之间。长柄熊巴掌则与锦香草属模式种圆叶锦香草、长穗花、光萼八蕊花和药囊花构成姐妹支，这也与Zhou等[13]的研究结果一致。综合所有聚类结果与地域关系的比较，锦香草更多按来源地聚类在一起，而短毛熊巴掌按地域关系聚类到同一支的趋势弱，表明锦香草相对短毛熊巴掌而言具有更强的地域性。

有关ITS序列差异鉴定与地理分布的研究已有很多报道。莫忠妹等[14]研究表明，nrITS序列可用来鉴定21个不同地区薤白(Alliummacrostemon)的亲缘关系；赵芹等[15]研究表明，ITS序列可区分不同产地瓠瓜(Lagenariasiceraria)品种的亲缘关系，不同产地品种间存在丰富的遗传变异和地理分化现象；刘长命等[16]通过ITS序列分析发现，不同生境萱草(Hemerocallisfulva)存在丰富的遗传变异和多样性，但未发现其与地理分布呈一定关系。本研究中，锦香草与短毛熊巴掌相互嵌入，且来自同一地区的显示出按地域特征的规律性聚集，长柄熊巴掌单独聚为一支无明显地域特征。结果表明，ITS序列在种内关系不同的物种之间所显示出的地域性特征也不同，符合王谈笑等[17-18]的研究结果。

锦香草及其近缘种在自然界中存在较为广泛，进行了大量的天然杂交，由此采用经典形态分类较为困难。本次研究基于ITS构建的ML树分析结果表明，ITS序列差异与地理分布存在一定的关系，ML树的亲缘关系结果支持《Flora of China》将短毛熊巴掌处理为锦香草的异名，而长柄熊巴掌亲缘关系较远，应为独立进化支，支持将其独立为一个种。