碱性盐胁迫对夏蜡梅光合荧光特性影响

周贝宁，毛 恋，花壮壮，芦建国

(南京林业大学 风景园林学院， 江苏 南京 210037)

盐碱地广泛分布于100多个国家和地区[1]，据不完全统计，全世界约有9.5亿hm2的盐碱地，相当于全球陆地总面积的7.23%[2]。有研究表明，盐碱化改变了土壤的理化特性，导致土壤肥效降低，通气性与透水性变差，产生高pH胁迫，并且严重限制了农林业的生产和可持续发展[3]。因此，合理的改良和开发利用盐碱地可以有效缓解耕地不足，提高土地利用率，改善我国农林业生产现状[4]。

夏蜡梅(Sinocalycanthuschinensis)为蜡梅科夏蜡梅属落叶灌木，我国二级珍稀濒危植物，产于浙江，现南京地区也已引种栽培。有别于传统冬季开花的蜡梅，夏蜡梅夏季开花，可观花观果，具有较高的观赏价值和清热止咳等一定的药用价值[5]。迄今为止，国内学者已经在形态分类、地理分布、引种栽培、物种生物学、系统与进化、孢粉学、细胞学和群落生态等方面对夏蜡梅进行了探究。目前，夏蜡梅野生资源遭到了严重破坏，野生分布范围在逐步缩小[6]。随着夏蜡梅野生分布资源逐步减少[7]，夏蜡梅抗逆生理的研究主要集中在水分、温度、干旱、NaCl及模拟酸雨胁迫对夏蜡梅生长及生理的影响方面，而对其他抗性与生理方面缺少深入研究。近几年的研究则主要侧重于繁育系统[8]、种子特性和光合生理[9]等方面。为扩大珍稀濒危物种夏蜡梅的引种栽培范围并为其合理开发利用提供依据。已有相关研究表明，夏蜡梅幼苗对NaCl胁迫具有一定的耐受能力[10-11]，而自然盐碱地中，同时存在的碱性盐对植物的危害远远高于单一盐胁迫。在碱性盐环境下，植物叶绿体结构受到破坏，叶绿素含量下降、光合基本参数发生一系列变化，因此，光合作用可以作为判断其耐盐碱能力的重要指标之一，叶绿素荧光参数的变化可作为判断植物受到盐碱迫害程度的重要指标[12]。本文以3年生夏蜡梅苗为材料，研究其在不同碱性盐胁迫下光合荧光特性的影响，包括光合特性、叶绿素荧光特性等相关光合荧光指标，为夏蜡梅今后的开发利用和生产实践栽培提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年5—7月在南京林业大学园林实验教学示范中心花房温室(32°30′N， 118°49′E)中进行，试验材料为3年生夏蜡梅实生苗，场地地势较为平坦，温室内设遮荫网并接收透过温室玻璃的自然光照。试验用盆为直径15 cm、高度13 cm的塑料花盆并配有托盘。栽培基质为园土、营养土按质量比1∶1混合而成，每盆统一装土1.5 kg(干土质量1.2 kg)。夏蜡梅实生苗适应期为1 a，期间进行日常养护管理，试验选择生长健壮、长势一致的夏蜡梅幼苗进行胁迫处理。

1.2 盐碱处理

试验以NaHCO3模拟碱性盐胁迫，根据盐分与土壤干质量之比设置CK、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%八个浓度梯度，土壤pH介于7.20～9.31。将试验材料随机分成9组，每组60盆，设3个重复。其中，在处理开始前对进行取样，测定土壤pH作为起始对照；CK为蒸馏水处理对照；剩余7组为梯度浓度的NaHCO3处理组。胁迫处理期间，在每日傍晚17:00—19:00进行浇灌，分5次缓慢浇灌以利于盐分在土壤中充分扩散，将托盘中渗出的盐溶液倒回盆中，处理60 d后结束试验。

1.3 生理指标测定

1.3.1 光合参数和光合响应曲线的测定

试验结束后，选择晴朗无风的天气，从每个处理中选取3株长势一致的夏蜡梅幼苗，在每株幼苗上选取3枚生长一致的向阳功能叶片。本试验采用CIRAS-3便携式光合仪，设置温度25 ℃、光合有效辐射1 200 μmol·m-2·s-1，在8:00—12:00测定植株的光合基本参数，包括净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、气孔导度(stomatal conductance，Gs)、蒸腾速率(transpiration rate ，Tr)、胞间CO2浓度(intercellular CO2，Ci)、水分利用效率(water use efficiency ， WUE)等指标。

通过控制红蓝光源，设置1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1共12个光合有效辐射，测定夏蜡梅幼苗Pn，利用非直角双曲线模型拟合光强响应曲线，分析最大净光合速率(maximum net photosynthetic rate，Pnmax)、光补偿点(light compensation point， LCP)、光饱和点(light saturation point， LSP)、暗呼吸速率(dark respiratory rate，Rd)和表观量子效率(apparent quantum efficiency， AQE)。

1.3.2 叶绿素荧光参数的测定

试验结束后，从每个处理中分别选取3株长势一致的夏蜡梅幼苗，在每株幼苗上选取3枚生长一致的向阳功能叶片，测定时间为每日8:00—12:00，将叶片暗适应20 min之后采用连续激发式荧光仪Handy-PEA测定夏蜡梅叶片快速O-J-I-P荧光诱导动力学曲线和快速叶绿素荧光基本参数，Fo是初始荧光，Fm是打开饱和脉冲测定的最大荧光，根据所测数据计算得到可变荧光(Fv=Fm-Fo)、潜在光化学效率(Fv/Fo)和PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)；通过快速O-J-I-P荧光诱导动力学曲线进行JIP-test分析PSⅡ反应中心的4个活性参数，即单位活性反应中心吸收的光能(ABS/RC)、捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)、捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)和耗散的能量(DIo/RC)。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016和SPSS 23.0进行统计，并对相应结果进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 碱性盐胁迫对夏蜡梅光合特性的影响

2.1.1 碱性盐胁迫对夏蜡梅光合参数的影响

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅Pn呈下降趋势，且碱性盐浓度越高，胁迫效果越显著(图1)。除了0.1%处理外，其他处理的夏蜡梅Pn与对照相比均极显著下降，分别下降了40.54%、59.18%、65.31%、89.90%、93.88%和95.92%，说明低浓度(0.1%)碱性盐胁迫下的夏蜡梅Pn无显著变化，而高浓度则明显抑制夏蜡梅正常的光合作用。

夏蜡梅Tr变化与Pn变化趋势基本一致，呈现下降趋势且浓度越高下降越为显著(图1)。与对照组相比，0.1%处理下的夏蜡梅蒸腾速率仅下降了1.10%，其他处理均极显著(P<0.01)下降，分别下降了30.39%、37.29%、38.95%、40.88%、62.43%和65.47%，说明高浓度下的碱性盐胁迫导致夏蜡梅的蒸腾速率显著下降。

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅Gs整体呈下降趋势(图2)。0.1%、0.2%、0.3%、0.4%处理与对照之间差异不显著，与对照相比下降幅度介于2.38%～36.51%，而0.5%、0.6%、0.7%处理极显著(P<0.01)低于对照，与对照相比分别下降53.97%、69.05%和65.08%，说明低浓度碱性盐处理下的夏蜡梅气孔导度Gs无显著变化，而高浓度的碱性盐胁迫导致夏蜡梅叶片气孔的张开程度显著降低。

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅WUE呈下降趋势，变化趋势与Pn和Tr基本一致(图2)。0.1%、0.2%处理的夏蜡梅水分利用效率WUE与对照差异不显著，相比对照均仅下降25.20%，而0.3%处理显著下降38.55%，0.4%、0.5%、

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著。下同。Different lowercase letters indicated significant differences at P<0.05, Different uppercase letters indicated significant differences at P<0.01, The same letters indicated insignificant differences.The same as below.图1 碱性盐胁迫对夏蜡梅净光合速率和蒸腾速率的影响Fig.1 Effect of alkaline salt stress on net photosynthetic and transpiration rate of Sinocalycanthus chinensis

图2 碱性盐胁迫对夏蜡梅气孔导度、水分利用效率的影响Fig.2 Effect of alkaline salt stress onstomatal conductance and water use efficiency of Sinocalycanthus chinensis

0.6%、0.7%处理则极显著下降，分别下降63.96%、81.33%、89.56%和96.89%，说明低浓度的碱性盐胁迫下，夏蜡梅能满足自身生长对水分的需求，对逆境胁迫有主动调节作用和高度适应性，在高浓度胁迫下夏蜡梅调节利用水分的能力明显下降。

与其他光合参数的变化不同，随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅Ci呈先降低后升高的趋势，在0.3%处理下达到最低值(图3)。0.1%、0.2%、0.3%、0.4%处理的夏蜡梅Ci与对照相比分别下降了10.10%、18.25%、21.36%和16.99%，而0.5%、0.6%、0.7%处理则分别上升9.13%、19.90%和21.55%，且0.6%、0.7%处理的夏蜡梅与对照之间差异极显著。说明在低浓度(≤0.3%)的碱性盐胁迫下，夏蜡梅叶片气孔部分关闭，外界CO2进入细胞受到限制；高浓度(>0.3%)的碱性盐胁迫严重破坏了夏蜡梅的光合结构，导致光合速率下降的同时降低叶片利用CO2的能力，细胞由于呼吸作用致使Ci上升。

图3 碱性盐胁迫对夏蜡梅胞间CO2浓度的影响Fig.3 Effect of alkaline salt stress on intercellular CO2 concentration of Sinocalycanthus chinensis

2.1.2 碱性盐胁迫对夏蜡梅光合响应特性的影响

在碱性盐NaHCO3胁迫下，夏蜡梅光合响应曲线的变化如图4所示。随着光合有效辐射(photosynthetically active radiation， PAR)的增加，不同浓度处理的夏蜡梅Pn均呈现先上升后逐渐趋于平缓的趋势，且对照与0.1%处理的夏蜡梅Pn差异不显著，而与高浓度0.5%、0.6%、0.7%处理之间差异显著。

图4 碱性盐胁迫下夏蜡梅光合响应曲线的变化Fig.4 Changes in photosynthetic response curves of Sinocalycanthus chinensis under alkaline salt stress

随着处理浓度的升高，夏蜡梅Pnmax与LSP整体呈现下降趋势，LCP则不断上升(表1)。各处理的夏蜡梅Pnmax与对照之间差异均极显著，与对照相比下降幅度介于8.45%～92.81%。与Pnmax变化趋势相同，各处理下的夏蜡梅LSP与对照相比差异均极显著，分别下降了7.68%、12.71%、12.61%、27.82%、36.58%、51.04%和52.79%。各处理的夏蜡梅LCP与对照相比均显著或极显著上升，0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%处理分别上升19.88%、137.57%、146.63%、199.66%、217.09%、239.56%和277.42%。AQE在不同浓度的碱性盐胁迫下均呈现出不同程度的下降。Rd在不同碱性盐胁迫下的变化规律不明显。

表1 碱性盐胁迫下夏蜡梅光合响应参数的变化Table 1 Changes in Photosynthetic response parameter of Sinocalycanthus chinensis under alkaline salt stress

2.2 碱性盐胁迫对夏蜡梅叶绿素荧光特性的影响

2.2.1 碱性盐胁迫对夏蜡梅快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的影响

低浓度的NaHCO3胁迫下，夏蜡梅快速叶绿素荧光诱导动力学曲线与对照相比无显著变化(图5)。随着胁迫浓度的升高，逐渐由O-J-I-P曲线变为O-K-J-I-P曲线(曲线在300 μs出现拐点K点，K点作为放氧复合体受伤害的一个特殊标志)，往往是由于水裂解系统和受体侧部分被抑制所造成[13]。与对照和低浓度处理相比，0.5%、0.6%、0.7% NaHCO3胁迫处理在K相到J相之间荧光值出现升高，说明高浓度的NaHCO3胁迫下，夏蜡梅PSⅡ反应中心受体侧瞬时大量积累而导致其电子传递受阻。

图5 碱性盐胁迫下夏蜡梅快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的变化Fig.5 Changes in fast chlorophyll fluorescence induction kinetic curve of Sinocalycanthus chinensis under alkaline salt stress

2.2.2 碱性盐胁迫对夏蜡梅PSⅡ受体侧及供体侧的影响

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片Vj(J点相对可变荧光)缓慢上升(图6)，尤其在0.7%处理下，Vj显著或极显著高于对照和其他处理，且与对照相比上升了23.74%，说明高浓度的碱性盐NaHCO3胁迫下，夏蜡梅叶片的电子传递在PSⅡ反应中心受体侧受阻。随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片Wk(K点可变荧光占J点可变荧光的比例)呈先缓慢下降后上升的趋势，0.3%处理达最低值且与对照相比下降9.44%，0.7%处理达最高值且与对照相比上升6.62%，说明高浓度的碱性盐胁迫会破坏夏蜡梅PSⅡ反应中心供体侧，导致放氧复合体(oxygen-evolving complex， OEC)数量明显减少，而低浓度(≤0.3%)胁迫下则无显著变化。

图6 碱性盐胁迫对夏蜡梅叶片Vj、Wk的影响Fig.6 Effect of alkaline salt stress on Vj and Wk of Sinocalycanthus chinensis

2.2.3 碱性盐胁迫对夏蜡梅叶绿素荧光参数的影响

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片Fo先下降后上升，0.3%处理的夏蜡梅叶片Fo最低且与对照相比下降5.81%，之后逐渐上升至0.7%处理下达到最高值，且与对照相比上升了24.89%，0.6%、0.7%处理与对照之间差异显著或极显著(表2)。随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片最大荧光Fm和可变荧光Fv均呈先升高后降低的趋势，0.3%处理的Fm和Fv均达到最高且与对照相比分别上升10.48%和12.05%，0.7%处理下Fm和Fv均最低且与0.3%处理之间差异显著或极显著。同样，随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm和PSⅡ潜在光化学效率Fv/Fo均呈先上升后下降的趋势，0.3%处理的Fv/Fm和Fv/Fo均最高，与对照之间差异不显著，而0.7%处理的Fv/Fm和Fv/Fo均最低且与对照和其他处理之间均差异显著或极显著。

表2 碱性盐胁迫下夏蜡梅叶绿素荧光参数的影响Table 2 Effect of alkaline salt stress on chlorophyll fluorescence parameters of Sinocalycanthus chinensis

2.2.4 碱性盐胁迫对夏蜡梅PSⅡ反应中心活性的影响

随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、热耗散的能量(DIo/RC)及捕获的用于还原QA(电子受体)的能量TRo/RC均先稍有降低后逐渐升高(表3)，且均在0.3%处理下达到最低值，与对照相比分别下降12.43%、19.05%和10.92%，之后逐渐上升并均在0.7%处理下达到最高值，与对照相比分别上升15.53%、56.35%和6.21%。用于单位反应中心电子传递的能量ETo/RC呈逐渐下降的趋势，对照组的ETo/RC值最大，0.7%处理下最小，且与对照相比下降了38.53%。

表3 盐胁迫下夏蜡梅PSⅡ反应中心活性的影响Table 3 Effect of alkaline salt stress on PSⅡreaction center activity of Sinocalycanthus chinensis

3 结论与讨论

3.1 碱性盐胁迫对夏蜡梅光合特性的影响

植物正常的生长发育需要依靠光合作用提供物质基础，同时光合能力的强弱可以反映植物的生长状况。盐碱胁迫会降低植物的光合作用，进而影响植物的正常生长，因此光合参数可作为判断植物耐盐碱性强弱的重要指标。Pn是衡量植物光合作用强弱的重要参数，同时与Tr、Gs、Ci、WUE等参数密切相关，共同调控植物光合作用。在本试验中，随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅Pn、Tr、Gs、WUE均呈下降的趋势，说明碱性盐胁迫对夏蜡梅的光合系统造成了损伤，且浓度越高所造成的损伤程度越高，因为随着碱性盐浓度的增加，夏蜡梅叶片受渗透胁迫影响导致气孔导度下降，气孔阻力增大，整体植株为减少水分流失并抑制蒸腾速率，提高夏蜡梅的水势以缓解碱性盐胁迫，维持光合作用，这与章华婷等[11]、毛桂莲等[14]、Parida等[15]等研究结果一致。

碱性盐胁迫下，植物光合速率下降的原因主要有气孔限制和非气孔限制，气孔限制通常表现为气孔关闭，气孔导度下降，外界CO2进入叶片受到限制，从而导致Ci降低，Pn下降，气孔限制造成的光合速率下降一般是暂时的、可逆的；非气孔限制表现为高浓度的碱性盐胁迫破坏了植物光合结构，导致Pn、Tr、Gs下降，进而叶片利用CO2的能力下降，因此Ci升高，这种由于光合机构遭到破坏而导致光合速率下降通常是不可逆的[16]。有学者认为，判断气孔限制或非气孔限制主要看Ci的变化情况，非气孔限制的必要条件为Pn和Gs下降，而Ci上升[17]。在本试验中，Pn和Gs随着NaHCO3浓度的升高不断下降，而Ci则呈先下降后上升的趋势，说明在低浓度(≤0.3%)处理下，气孔因素限制是夏蜡梅叶片Pn下降的主要因素，但随着碱性盐浓度的升高，Ci逐渐上升并与Pn和Gs的变化趋势相反，此时非气孔因素限制成为夏蜡梅叶片Pn下降的主要因素，即高浓度的碱性盐胁迫破坏了夏蜡梅的光合结构，导致光合速率下降，而胞间CO2浓度上升，这与水稻中的研究结果一致[18]。

光合响应曲线能够反映光量子通量密度与植物净光合速率之间的关系，而光合响应各项参数能够反映胁迫过程中植物利用光强能力的变化[19]。在本试验中，随着碱性盐NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅Pnmax不断下降，且浓度越高下降越明显，说明高浓度的碱性盐胁迫显著降低夏蜡梅最大光合潜能。LSP和LCP是衡量植物需光特性的指标，分别代表了植物对光强需求的上限和下限，反映植物对强光和弱光的利用能力[20]，其中LCP值越小代表利用弱光的能力越强。在本试验中，随着碱性盐胁迫浓度的升高，夏蜡梅LSP不断下降，而LCP不断上升，0.1% NaHCO3处理下的变化不显著，而NaHCO3浓度越高则变化越显著，说明高浓度的碱性盐胁迫严重降低了夏蜡梅利用强光和弱光的能力和范围。AQE反映了植物吸收和转化利用光能的能力，同时是光合作用光能转化效率的指标之一[21]。本试验中，不同浓度的碱性盐胁迫下的夏蜡梅AQE均低于对照，且浓度越高下降越明显，说明碱性盐胁迫抑制了夏蜡梅对光能的转化及利用效率，这与隋德宗等[22]研究结果一致。

3.2 碱性盐胁迫对夏蜡梅叶绿素荧光特性的影响

叶绿素荧光与植物光合作用密切相关，植物叶片叶绿素荧光的变化可反映出环境胁迫对光合作用的破坏程度[23]。正常情况下，快速叶绿素荧光动力学曲线在荧光上升阶段有O、J、I、P相，J点相对可变荧光Vj上升，通常反映了PSⅡ反应中心受体侧QA大量积累，电子在受体侧的传递受阻；Wk反映了PSⅡ反应中心供体侧受损伤的程度，Wk值越大，表明放氧复合体OEC数量越少，损伤程度越大[24]。在本试验中，高浓度的NaHCO3胁迫下，夏蜡梅叶片的O-J-I-P曲线逐渐变形为O-K-J-I-P曲线，出现了明显的K点，说明高浓度的NaHCO3胁迫导致夏蜡梅叶片OEC数量明显下降，严重破坏了PSⅡ反应中心供体侧，且Vj随着胁迫浓度的升高缓慢上升，说明NaHCO3胁迫降低了夏蜡梅叶片PSⅡ反应中心受体侧电子传递能力，光合电子QA向QB的传递过程受阻，大量QA积累[25]。光合作用通过光系统PSⅠ和光系统PSⅡ将光能转化为化学能，其中 PSⅡ对盐胁迫尤其敏感并在植物响应盐胁迫的过程中发挥重要作用[26]。Fo与Fm分别表示光系统PSⅡ反应中心处于完全开放和完全关闭时的荧光量，Fv代表原初电子受体QA的还原状态[27]。PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm在正常情况下变化不大，一般为0.80～0.85[28]，而植物在逆境胁迫下会产生光抑制[24]，导致Fv/Fm显著下降，而当Fv/Fm值低于0.80时，外界胁迫会对PSⅡ反应中心造成一定损伤[29]；Fv/Fo可反映盐碱胁迫对植物PSⅡ潜在活性的损伤程度。本试验中，随着NaHCO3浓度的升高，夏蜡梅叶片Fo先下降后上升，0.3%处理下达到最低值后不断上升；而Fm、Fv、Fv/Fm和Fv/Fo则呈先上升后下降，0.3%处理下达到最高值后不断下降，低浓度(≤0.3%)NaHCO3胁迫下夏蜡梅Fv/Fm为0.80～0.83，说明对夏蜡梅叶片光化学性能和PSⅡ反应中心影响不大，其潜在活性和光能转换效率并没有减弱，夏蜡梅发生光抑制作用不明显，而高浓度胁迫下则产生了光抑制，PSⅡ反应中心的实际光能捕获效率逐渐降低，所捕获的用于光化学反应的光能逐渐减少，导致Fv/Fo和Fv/Fm显著下降，PSⅡ潜在活性受损，这可能是高浓度碱性盐胁迫下夏蜡梅光合速率下降的一个重要因素。

PSⅡ反应中心活性能够反映盐碱胁迫对植物叶片光合机构的伤害程度，4个具体参数ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC与DIo/RC反映了电子受体 QA处于可被还原状态时，单位PSⅡ反应中心的活性，碱性盐胁迫一方面使夏蜡梅叶片 PSⅡ反应中心部分失活，另一方面影响了天线色素的结构[30]。在本试验中，夏蜡梅叶片ABS/RC、DIo/RC与TRo/RC均随NaHCO3浓度的升高呈先下降后上升趋势，且均在0.3%处理下达到最低值，ETo/RC逐渐下降，说明低浓度(≤0.3%)的碱性盐胁迫可适当提高PSⅡ反应中心活性，高浓度的碱性盐胁迫则造成夏蜡梅叶片大部分PSⅡ反应中心失活。

综上所述，碱性盐NaHCO3胁迫损伤了夏蜡梅的光合系统，且随着浓度的升高所造成的损伤程度越大，综合分析气体交换参数表明，低浓度NaHCO3胁迫下，夏蜡梅Pn下降的原因是气孔限制，高浓度胁迫下则可能是非气孔限制。低浓度NaHCO3胁迫对夏蜡梅叶片光化学荧光性能影响不大，甚至适当提高了PSⅡ反应中心活性，高浓度胁迫则严重破坏PSⅡ反应中心供体侧、受体侧，以及导致大部分PSⅡ反应中心失活，这与光合参数的变化基本一致。因此，夏蜡梅对低浓度(≤0.3%)的碱性盐具有一定的耐受性，高于0.3%浓度的盐碱地环境则不适合夏蜡梅的推广栽培。