串联质谱技术检测孕妇胆汁酸谱的性能评估及其参考区间建立*

陈 辰，陈亚军，蒋翠莲，马金飞，李义坤，钟天鹰△

1.南京医科大学附属妇产医院/南京市妇幼保健院检验科,江苏南京 210004；2.杭州凯莱谱医学检验实验室,浙江杭州 310000

肝脏是人体重要的代谢器官，肝细胞以胆固醇为原料合成胆汁酸经胆管排入十二指肠，协助脂类物质完成消化吸收后，再通过门静脉回流被肝脏重吸收，形成胆汁酸的“肠肝循环”[1-2]。胆汁酸的组成和结构较为复杂，按结构可分为两大类,一类是游离型胆汁酸[3-4],包括胆酸(CA)、 脱氧胆酸(DCA)、 鹅脱氧胆酸(CDCA)、 熊脱氧胆酸(UDCA)和石胆酸(LCA)[5]；另一类是结合型胆汁酸[6],为游离型胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的结合物[7]。多种不同类型的胆酸共同构成了胆汁酸谱。一旦肝脏或胆囊发生病变，如肝炎、肝硬化、胆石症、妊娠期胆汁淤积症(ICP)等，胆汁酸的“肠肝循环”受阻，血液中的胆汁酸水平升高，这些疾病的总胆汁酸(TBA)升高水平可能接近，但胆汁酸谱的成分不同，测定TBA水平对肝胆疾病的鉴别有局限性。因此，胆汁酸谱亚型检测对于肝胆疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。近年来有研究表明，通过质谱技术对胆汁酸谱亚型进行测定，可以有效提高肝胆疾病的诊断效率[5]。由于以往的测定方法比较烦琐，并且没有适合于特定人群(如孕期、儿童)的胆汁酸谱参考区间，限制了其在临床实验室的推广应用。本研究拟建立一种基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术的血清胆汁酸谱检测方法，并进行性能评估，有利于孕期不同肝胆疾病的鉴别诊断，并建立适合于孕期的胆汁酸谱参考区间，以便更及时、有效地对孕期肝胆疾病进行干预。

1 资料与方法

1.1仪器与试剂 仪器：ABsciex 4500三重四极杆质谱仪，Jasper系列高效液相色谱仪(美国ABsciex公司)；试剂：甲醇(HPLC级，美国Merk公司)，乙酸铵(MS级，美国SIGMA公司)，样本前处理试剂(含氘代内标的甲醇溶液)购自迪安生物有限公司，纯净水为市售屈臣氏蒸馏水。

1.2混合标准品溶液配置 胆汁酸亚型标准品购自美国SIGMA公司，制成混标溶液后逐级稀释为7种浓度梯度(S1～S7浓度比为：1∶2∶5∶20∶50∶100∶200)，各亚型浓度见表1。

表1 混标溶液各浓度点各亚型胆汁酸浓度(ng/mL)

1.3样本收集 随机选取南京医科大学附属妇产医院2018年7-8月产科门诊某诊室所有孕中期初次常规产前检查表观健康孕妇。纳入标准：年龄22～40岁，孕周14～28周。剔除标准：肝胆疾病、肝功能异常，心血管疾病及肾脏病等慢性病，以及吸烟、酗酒等不良生活习惯。空腹抽血后立即离心，剔除溶血、脂血样本于-80 ℃保存，共146例入组。随机选取其中126例用于建立15种亚型参考区间，其余20例用于验证参考区间。

1.4方法

1.4.1样本处理 取50 μL样本，加入120 μL前处理液，漩涡10 min，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，吸取上清液100 μL待测。

1.4.2色谱条件 安捷伦Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5 μm)色谱柱；柱温50 ℃；流动相A：纯净水，流动相B：纯甲醇(HPLC级，含5 mmol/L乙酸铵)；流速：0.85 mL/min,采用梯度洗脱：0.0～0.8 min,65% B，0.8～2.8 min,65%～82% B，2.8～3.2 min,82%～83% B，3.2～5.3 min,83%～85% B，5.3～5.4 min,85% B，5.4～7.5 min,85%～98% B，7.5～9.0 min,65% B。进样量：10 μL。

1.4.3质谱条件 电喷雾离子源、负离子扫描模式、MRM多反应监测模式、离子源温度550 ℃。15种胆汁酸亚型质谱优化参数及保留时间见表2。

表2 15种胆汁酸亚型质谱优化参数及保留时间

1.5性能评估 参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)C62-A 文件[8]和美国食品药品监督管理局的生物分析方法验证导则标准[9]对建立的LC-MS/MS技术测定胆汁酸谱的方法进行基本分析性能验证。

1.5.1最低定量限(LLMI)和最低检出限(LoD) 取混合标准品溶液S1，稀释至1/4S1、1/8S1，3种浓度重复测定10次，分别计算15种亚型10次测定结果的平均值，计算标准差(s)、变异系数(CV)、偏倚(Bias)，以CV<20%，Bias<15%，S/N>20为LLMI可接受标准，以CV<20%，Bias<15%，S/N>3为LoD可接受标准[8]。

1.5.2线性评价 将混合标准品溶液S6浓度作为高值(H)，S2浓度作为低值(L)，按照4H、3H+L、2H+2L、3L+H、4L配制成5种不同浓度的溶液，每种浓度重复检测5次，计算均值、CV、与理论值的Bias，CV<15%、Bias<15%，计算出回归方程，且r2>0.99,即可判为线性[8]。

1.5.3准确度评价 健康人混合血浆混匀后取3份，每份1 mL，分别添加不同体积的混合标准品S1溶液(10、30、100 μL)，检测样本中15种胆汁酸亚型浓度，每份样本重复检测5次取均值，计算加标回收率，并与理论值进行比较，计算Bias。Bias<15%，且加标回收率需满足80%～120%，即判断为可接受[8]。

1.5.4精密度评价 批内精密度：健康人混合血浆混匀后取3份，每份1 mL，分别添加相同体积不同浓度的混合标准品溶液(S2、S4、S6)，制成低值、中值、高值样本，检测3份样本中15种胆汁酸亚型水平，每份样本重复检测20次取均值，计算s和CV，CV<15%即判断为可接受。批间精密度：将上述加标处理后的3份血浆分别用EP管分装，-20 ℃冰冻保存，使用前37 ℃快速复融，使用相同批号的试剂每天测定4次，连续5 d，计算s和CV，CV<15%即判断为可接受。

1.5.5携带污染情况 采用混合标准品溶液S3、S5、S7依次进样后，用甲醇作为空白样本进样，测定空白的峰面积响应，连续反复5次，以每次测得的峰面积响应值小于LoD响应值的25%为通过标准[8]。

1.6本地区正常孕妇胆汁酸谱参考区间的建立和验证 根据CLSI EP28-A3c[9]文件推荐的方法和程序，采用Dixon法剔除离群值后，最终入组126例，拟建立适合于南京地区表观健康孕中期孕妇胆汁酸谱各组分参考区间。根据小样本验证法[10]，选择剩余20例参考个体进行检测，将结果与待验证的参考区间进行比较，若超出参考区间的数据不超过2例，则通过验证；如超过2例，则另选择20例合格参考个体重复以上验证过程。

2 结 果

2.1LLMI和LoD 稀释标准品，当标准品浓度为混合标准品浓度S1时，重复检测10次，满足每种亚型CV均<15%,且S<10%，信噪比>20∶1，各种亚型的LLMI为混合标准品曲线中S1的浓度。而浓度在1/4 S1时，信噪比满足>3∶1，CV和s满足LoD的要求，但不能满足LLMI的要求，故1/4 S1浓度为该胆汁酸谱检测方法的LoD。

2.2线性范围 通过7种不同的浓度点构建标准曲线。以质量浓度(ng/mL) 为X轴，各胆汁酸扣除空白后的峰面积与内标峰面积之比为Y轴,进行线性回归分析,得到15种胆汁酸的线性回归方程和回归系数。15种胆汁酸在仪器检测范围内呈良好的线性关系，线性范围满足临床检测需求，r2为0.993～0.999，均大于0.990,符合线性范围验证的要求。见表3。

表3 15种胆汁酸亚型拟合标准曲线和检测线性范围

2.3准确度及精密度 加标后测定3种浓度(低、中、高)的血清样本15种胆汁酸亚型的平均加标回收率均满足80%～120%，且Bias<15%，符合准确度评估要求；3种浓度的血清样本15种亚型批内精密度和批间精密度的最大CV分别为13.26%和11.38%，均小于15%，满足精密度评估要求。见表4。

表4 准确度及精密度(%)

续表4 准确度及精密度(%)

2.4携带污染率 15种胆汁酸亚型5次高值进样后的空白残留最大峰面积响应值为7 000，远远小于最低定量检出限响应值的25%(16 000)，因此可认为该法不存在明显的携带污染。

表5 健康孕妇孕中期15种胆汁酸亚型生物参考区间

3 讨 论

近年来，胆汁酸各种亚型作为信号分子在孕期能量代谢中发挥的作用，成为代谢研究的热点[11-13]。本研究基于LC-MS/MS技术建立一种简单、快速测定胆汁酸谱的方法。用胆汁酸各种亚型标准品和对应氘代物建立标准曲线，以达到精准定量的目的。LC-MS/MS技术灵敏度高、特异性好，近年来已被用于总胆汁酸谱的临床检测。与之前报道的方法比较，LC-MS/MS技术在样本前处理上使用了成本低廉的甲醇，且将蛋白沉淀涡旋后的离心时间延长为4 ℃下10 min，最大程度去除杂质。在保证检测灵敏度的前提下，摒除了氮吹复融步骤，以减少操作误差。为保证检测体系的弱碱性，避免酸性物质的离子抑制作用，在流动相B中添加了5 mmol/L乙酸铵。由于15种胆汁酸各种亚型在水中的溶解度差异较大，并存在3组同分异构体，故对其梯度进行优化，降低了初始流动相中水相的比例，每一种同分异构体亚型都呈现出较好的分离效果。每份样本15种胆汁酸亚型的检测时长仅为9 min，极大提升了检测效率。

鉴于长江中下游地区为孕期ICP高发地区[14]，南京市妇幼保健院为妇产科专科医院，患者以孕产妇为主，不应直接套用健康人群参考区间。本研究建立了适合于本地区孕中期孕妇胆汁酸谱参考区间并通过验证，有利于孕期不同肝胆疾病的鉴别诊断，指导临床及时有效地对孕期肝胆疾病进行干预。

本研究具有一定的临床应用价值，基于质谱技术建立的方法可以精准、快速地定量检测胆汁酸谱，同时检测胆汁酸谱中的15种亚型，有利于肝胆疾病的鉴别诊断。本研究建立了适合于本地区孕妇胆汁酸谱的参考区间，利用胆汁酸谱检测结果可指导孕期肝胆疾病的诊疗。