代谢重编程对骨肉瘤发生发展影响的研究进展

韩倞 刘哲辉 华莹奇 蔡郑东

骨肉瘤 (osteosarcoma，OS) 是常见于儿童和青少年的恶性骨肿瘤，其治疗方法在 20 世纪 70 年代的截肢手术逐渐演变为目前的化疗联合保肢手术，但 5 年生存率依然仅有约 70%[1]。在治疗过程中，肿瘤持续不断的发生发展是克服疾病的主要障碍，而肿瘤的能量代谢异常也成为肿瘤的十大标志之一[2]。近年来有大量研究发现，肿瘤的代谢重编程在肿瘤的发生发展方面起到了重要作用[3-5]。

代谢重编程是肿瘤细胞为在极端微环境下存活而对其合成和分解代谢进行调节，以获得所需能量和物质而进行的过程[3]，该过程主要涉及糖类、脂质、氨基酸、核苷酸等代谢途径[6]。随着研究进展，乳酸等以往被认为无用的代谢产物也被发现参与了重要代谢过程，因此细胞代谢所涉及的范围也不断扩大[3]。鉴于越来越多的研究发现代谢重编程在 OS 的发生发展中起到了重要作用，笔者综述了在 OS 中糖代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等物质及能量代谢途径的变化对 OS 发生发展的影响。

因此，以“osteosarcoma”、“metabolic OR metabolism”以及糖、氨基酸、脂质代谢过程中的各种酶和代谢产物英文名作为关键词、主题词，在 PubMed 数据库中检索，检索时间截止至 2020 年 10 月，检索近 5～10 年内的文献，共 677 篇。设定的纳入标准：研究类型为原创研究、综述、临床试验；研究内容与 OS 的代谢重编程相关；对概念、生理过程及物质的分子生物学功能的必要阐释。排除标准：文章类型为观点、评述；无法获得全文。本综述选取相关文献 55 篇，围绕代谢重编程对 OS 发生发展的影响进行综述。

一、糖代谢

作为细胞内重要的代谢物质之一，葡萄糖存在多种合成和分解途径。糖合成代谢主要包括糖异生、糖原合成；而糖分解代谢主要包括发生于细胞质的糖酵解途径、磷酸戊糖途径 (pentose phosphate pathway，PPP)、丝氨酸合成途径以及发生于线粒体的三羧酸循环 (tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 和氧化磷酸化。其中糖酵解作为核心代谢途径，将葡萄糖转化为丙酮酸。丙酮酸随后可通过无氧酵解产生乳酸并转运出细胞外，也可进入线粒体氧化产能。糖酵解的中间产物则作为分支代谢途径的起点：葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-phosphate，G-6-P) 可进入 PPP， 3-磷酸甘油酸可进入丝氨酸合成途径[6]。

1. 糖酵解：葡萄糖代谢主要有两种产能方式：有氧氧化和无氧糖酵解。糖酵解是二者的共同通路，1 mol 葡萄糖通过糖酵解分解为 2 mol 丙酮酸，同时产生 2 mol 三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)，ATP 是生物体内的直接供能物质。此后随环境中氧含量不同，丙酮酸会进入不同的代谢途径。在有氧环境中，2 mol 丙酮酸进入线粒体氧化脱羧生成乙酰辅酶 A，随后进入 TCA cycle，生成的还原性物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide，NADH) 和黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体 (flavine adenine dinucleotide，reduced，FADH2) 经电子传递链释放能量，生成大量 ATP，完成氧化磷酸化过程。最终 1 mol 葡萄糖经有氧氧化产生 30 或 32 mol ATP。若是在缺氧环境下，2 mol 丙酮酸会在细胞质中转化为 2 mol 乳酸，随后转运至细胞外，该过程不产生额外的 ATP。最终 1 mol 葡萄糖通过无氧糖酵解产生 2 mol ATP[7]。

正常细胞增殖程度有限，而肿瘤细胞增殖迅速且不受限制，因此肿瘤细胞必须产生更多能量以满足其增殖需要。无论氧气含量是否充足，肿瘤细胞总是倾向于通过无氧糖酵解而非有氧氧化产能 (Warburg 效应)[8]。如前所述，无氧糖酵解产生的能量远少于有氧氧化，因此肿瘤需要从环境中摄取更多的葡萄糖。目前已经确认了多种如 Myc、Ras 等癌基因，可通过缺氧诱导因子 (hypoxia inducible factor，HIF) 影响肿瘤的糖代谢水平[9]。在缺氧条件下，HIF-1α 降解减少，葡萄糖转运体 1 (glucose transporter 1，GLUT1) 表达水平显著提高，使肿瘤细胞能够更迅速地摄取葡萄糖。Fan 等[10]检测了 51 例 OS 标本及其癌旁组织中 GLUT1 及其 mRNA 的表达水平，其中 38 例 (74.5%) OS 标本 GLUT1 表达水平升高而癌旁组织仅有 6 例 (11.8%) 升高，且肿瘤组织 mRNA 水平也显著高于癌旁组织。Kang、Chen 等[11-12]发现，抑癌基因长链非编码 RNA (Long noncoding RNA，lncRNA) HAND2-AS1 在 OS 患者的肿瘤组织中表达水平显著低于癌旁组织，该蛋白能够抑制 HIF-1α，在 MG-63 和 Saos-2 细胞中沉默该基因后 GLUT1 表达量显著上升，葡萄糖摄取量增加，OS 患者肿瘤大小也与其 HAND2-AS1 的血清水平呈负相关。

己糖激酶 2 (hexokinase 2，HK2) 是催化糖酵解第一步的限速酶，能将进入细胞的葡萄糖转化为 G-6-P。在 OS 中已经发现多种调控 HK2 的代谢通路和物质。Liu 等[13]发现，与癌旁组织相比，miR-185 在 OS 组织中的表达水平明显降低，该物质能够与 HK2 mRNA 的 3’ 端非翻译区结合，阻断翻译过程。在 OS 细胞中过表达 miR-185 能相应地下调 HK2 的表达水平，使用 miR-185 抑制物将促进 OS 细胞无氧糖酵解和细胞增殖。Song 等[14]发现 lncRNA PVT1 在 OS 中表达升高，该物质为 miR-497 的内源竞争 RNA (competing endogenous RNA，ceRNA)，能够竞争性结合 miR-497，进而上调 miR-497 的下游靶点 HK2，促进糖酵解，加速 OS 增殖和侵袭。沉默 PVT1 或过表达 miR-497 均能抑制肿瘤细胞的生长。Han 等[15]发现了 OS 细胞中高表达的 lncRNA TUG1 可通过上调 HK2 表达提高糖酵解水平，促进 OS 细胞体外增殖；Zhuo 等[16]也发现了 PI3K / Akt 信号通路可通过上调 HK2 促进 OS 糖酵解，靶向抑制 HK2 表达能够减少 OS 细胞的体外增殖。

醛缩酶 A (aldolase A，ALDOA) 是催化糖酵解中果糖-1，6-二磷酸转变为 3-磷酸甘油醛的酶。Long 等[17]在 MG-63 和 U2OS 细胞系中过表达 ALDOA 后，肿瘤细胞体外侵袭能力显著增强，基质金属蛋白酶 2 (matrix metalloproteinase 2，MMP2) 表达量也显著升高，而敲低后则得到相反的趋势。将过表达 ALDOA 的 MG-63 细胞移植至裸鼠后与对照组相比，其原发肿瘤体积更大，肺转移显著增加。Shen 等[18]发现 OS 中 IncRNA KCNQ1OT1 表达升高，该物质为 miR-34c-5p 的 ceRNA，可减弱后者靶向抑制 ALDOA 的效果，最终促进了 OS 增殖并抑制其凋亡。Chen 等[19]分析了 40 例 OS 临床标本，结果表明 ALDOA 表达量高的患者生存时间显著短于表达量低的患者。

以上研究表明，肿瘤细胞中葡萄糖转运体及 HK2、ALDOA 等糖酵解相关酶表达水平的升高使 OS 细胞能够摄取更多葡萄糖并提高其糖酵解水平，以此获得足够的能量，满足肿瘤发生发展需求。

2. 磷酸戊糖途径：除继续完成糖酵解外，G-6-P 还可进入分支代谢途径，即糖酵解。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD) 是该支线途径的限速酶，决定了糖酵解的水平[7]。糖酵解能够为细胞生命活动提供核糖和 NADPH，前者是合成核苷酸的原料之一，后者是重要的抗氧化物质[20]。

机体内存在氧化与抗氧化物质的平衡。在生理条件下，活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 主要产生于线粒体活动，因此在氧含量高、胞内葡萄糖水平高的情况下，其生成速率会增加[21]。抗氧化物质谷胱甘肽过氧化物酶需要消耗还原性谷胱甘肽 (glutathione，GSH) 并将 ROS 还原为无毒化合物，而 GSH 水平的维持则需要消耗 NADPH。因此，NADPH 含量在细胞氧化与抗氧化平衡中起到重要作用。当该平衡被破坏时，就会发生氧化应激，对细胞造成损伤，引起细胞死亡[22]。Wang 等[23]发现，在 OS 中表达异常升高的 IncRNA OR3A4 下调了 miR-1207-5p 的水平，减弱了后者对 G6PD mRNA 的抑制效果，因此 OS 中 G6PD 表达水平较正常组织更高。在 MG-63 和 Saos-2 细胞中下调 OR3A4 基因后，G6PD 表达量减少，NADPH 生成量随之减少，同时细胞内 ROS 水平升高程度与 NADPH 减少程度相一致，OS 细胞的存活率也显著降低。该研究表明，在 OS 中上调的 OR3A4 基因能够使磷酸戊糖途径水平升高，产生更多的 NADPH，保护肿瘤细胞不受氧化应激伤害，从而有助于肿瘤的发生发展。

3. TCA cycle 与氧化磷酸化：正常细胞中葡萄糖经过糖酵解转化为丙酮酸后，会进入线粒体进行 TCA cycle 与氧化磷酸化。然而在肿瘤中，丙酮酸更多地在细胞质中转化为乳酸，因此进入线粒体的量则相对减少。在分子水平上，该趋势则表现为 TCA cycle 与氧化磷酸化相关的酶和辅助因子等物质水平下降[9]。线粒体活动减少带来的直接影响是 ROS 的产生减少，使肿瘤细胞免受氧化应激损伤，从而有助于发生发展[9,21]。Zhang 等[24]对 24 例 OS 患者、19 例良性骨肿瘤患者和 32 例健康对照者的血清和尿液代谢产物进行了分析，结果显示 OS 患者 TCA 水平下调。

图1 骨肉瘤的代谢重编程及其潜在治疗靶点Fig.1 Metabolic reprogramming of osteosarcoma and its potential therapeutic targets

异柠檬酸脱氢酶 (isocitrate dehydrogenase，IDH) 能够将异柠檬酸转化为 α-酮戊二酸，是 TCA cycle 中的关键酶。该酶共有 3 个亚型，其中 IDH1 位于细胞质和过氧化物酶中，IDH2 和 IDH3 位于线粒体中[25]。目前已在膀胱癌、脑胶质瘤等多种肿瘤中发现 IDH 水平与肿瘤进展之间存在联系[25-26]。Hu 等[27]发现，IDH1 在 OS 组织中表达量较正常骨组织更低。在 143B 和 MG63 OS 细胞中上调 IDH1 后，与对照组相比，细胞凋亡率分别增加了 55% 和 29%，同时促凋亡蛋白 Bax 含量上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 含量下降，caspase-3 活性分别为对照组的 1.55 倍和 1.72 倍，侵袭活性减少 48.3% 和 56.2%，同时与细胞迁移和侵袭相关的 MMP-9、ICAM-1 和 VEGF 蛋白表达则被抑制。将过表达 IDH1 的 143B 细胞注射到裸鼠皮下后发现，肿瘤的生长速度较对照组明显减慢，平均重量减少 77.3%。将两种细胞的 IDH1 敲低，则观察到了趋势相反的结果。该研究证实了通过上调 IDH1 的表达在体内外环境中均能抑制 OS 的进展。Yi 等[28]观察到，在 44 例 OS 样本中，恶性程度高的组织中 IDH2 表达量较低。体外实验中下调 Saos-2 和 MG63 细胞的 IDH2 表达量，6 天后实验组相比对照组，生长速率分别提高至 1.7 倍和 1.5 倍，侵袭活性分别提高至 2.8 倍和 2.2 倍。进一步机制研究表明，IDH2 下调促进 OS 细胞生长侵袭与 NF-κB 的增加和 MMP-9 的激活有关。前者在炎症反应、免疫应答等过程中起到关键作用，后者能够降解细胞外基质，促进肿瘤侵袭[29-30]。

Zhu 等[31]发现，miR-23b-3p 在 MNNG-HOS、U2OS、MG63、Saos-2 四种 OS 细胞中水平升高。下调该物质表达水平后，体外实验显示 OS 细胞集落数量减少，在小鼠皮下成瘤模型上则表现为明显的肿瘤生长延迟，证明 miR-23b-3p 能够促进 OS 的增殖。此外，下调 miR-23b-3p 提高了 OS 细胞基础和最大耗氧率 (反映氧化磷酸化水平的指标) 而降低了基础和最大细胞外酸化率 (反映糖酵解水平的指标)，且氧化磷酸化产生的 ATP 和糖酵解产生的乳酸也相应地分别升高和降低。进一步机制研究发现 miR-23b-3p 通过直接靶向抑制过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅激活因子 1α (peroxisome proliferator activated receptor γ coactlvator-1α，PGC1α) 调控氧化磷酸化水平。PGC1α 是一种多功能转录辅激活因子，在线粒体稳态和氧化代谢中起到重要作用[32]，其表达量升高可提高氧化磷酸化水 平[33]。上调 PGC1α 增强了氧化磷酸化水平并抑制了 OS 细胞增殖，而下调则逆转了 miR-23b-3p 下调所产生的影响。以上研究证明了 OS 细胞中 miR-23b-3p 的升高能够抑制 PGC1α，使氧化磷酸化水平降低，而糖酵解水平增高，最终促进 OS 发生发展。

二、氨基酸代谢

肿瘤细胞为了满足快速增殖的能量需求，除糖代谢所需的能量来源外，氨基酸代谢的需求也有所提高。氨基酸在肿瘤细胞中，除合成细胞必须的蛋白质等基本原料外，还可作为能量代谢的调节物质[6]。在 OS 中，与代谢重编程相关的研究主要集中在谷氨酰胺代谢方面。

谷氨酰胺是除葡萄糖外肿瘤细胞用以进行能量代谢的代谢物质之一。在肿瘤细胞内，谷氨酰胺脱氨基变为谷氨酸，在谷氨酸脱氢酶的作用下变为 α-酮戊二酸，α-酮戊二酸经过 TCA cycle 后变为苹果酸或草酰乙酸，之后可用于合成丙酮酸，进而参与供能或其它物质的合成，肿瘤细胞可通过谷氨酰胺转运蛋白 (包括 ASCT2、SNAT1、SNAT2、SNAT4、LAT1 等[33])，而这种依赖谷氨酰胺的代谢方式已经成为多种肿瘤的代谢特点[34]。从细胞外摄取谷氨酰胺。Bröer 等[35]的研究表明，OS 细胞系 143B 细胞内丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的合成均依赖谷氨酰胺，并且在谷氨酰胺缺乏时，143B 细胞的生长将完全停止。抑制谷氨酰胺转运蛋白 SNAT1 / 2 的活性可使 143B 细胞增殖下降，但抑制 ASCT2 并未有类似效果，该研究表明在 143B 细胞系内 SNAT1 / 2 是谷氨酰胺的转运蛋白，而 ASCT2 等其它转运蛋白起到氨基酸的交换作用，并根据此提出肿瘤氨基酸稳态模型[36]。

除转运蛋白外，谷氨酰胺的代谢酶 (glutam-inase，GLS) 也在谷氨酰胺代谢中起重要作用，Zhang 等[37]的临床研究表示 GLS 表达水平越高，患者的生存时间相对越低，呈负相关。Ren 等[38]的研究发现，在体外培养过程中剥夺谷氨酰胺后，三种 OS 细胞系 MG63.3、143B、K7M2 的生长速度均显著降低，体内实验发现 GLS 抑制剂 CD-839 在小鼠 OS 模型中具有良好的抑制肿瘤生长的效果，而联合二甲双胍可使该效果更佳显著。

三、脂质代谢

脂质代谢在肿瘤生长中也扮演着重要角色[6]，而目前对 OS 的研究主要集中在脂肪酸代谢相关领域，例如 ATP 柠檬酸裂合酶 (ATP citrate lyase，ACLY)、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthase，FASN) 等。

ACLY 作为脂肪从头合成的第一个限速酶，将柠檬酸转化为草酰乙酸以及乙酰辅酶 A，目前已在多种肿瘤中观察到高表达量 ACLY 对肿瘤生长的促进作用[38-39]。Xin 等[39]发现较正常组织细胞，OS 细胞 ACLY 表达明显升高，并且 miR-22 可以在细胞系以及小鼠模型中抑制 ACLY 的功能，抑制肿瘤增殖和侵袭能力。而 FASN 是催化脂肪从头合成过程最后一步，同时 FASN 也是一个癌基因，在多种肿瘤中表达量均有升高[40]。研究表明，抑制 FASN 对于减缓 OS 的发生发展有明显效果[40-43]。Guo 等[44]发现核转录因子 NF-YA 可通过激活 FASN 信号通路来促进 OS 细胞系的恶性表型。Sun 等[45]在 OS 细胞系中的研究发现 FASN 通过调控 ERK1 / 2 / Bcl-xL 信号通路使 OS 细胞增殖以及迁移增强。Chen 等[46]发现沉默 FASN 可以降低 HER2 / PI3K / Akt 信号通路相关蛋白表达水平，在小鼠模型内可以抑制 OS 的生长及转移。

目前，在 OS 细胞脂质代谢的研究还相对缺乏，但 OS 细胞内 ACLY、FASN 等脂肪合成相关酶表达水平与 OS 细胞表型的相关性显示出了脂质代谢与 OS 发生发展的重要联系，脂质代谢的相关酶也可能成为治疗 OS 的重要 靶点。

总之，代谢重编程在肿瘤发展、转移与耐药中的作用已经得到了越来越多的揭示。增进对肿瘤代谢重编程的理解能够为肿瘤的治疗提供更多策略，目前已有多种靶向肿瘤各种代谢途径的药物，如已经批准上市的 mTOR 通路抑制剂 temsirolimus 和 everolimus、进入临床研究的谷氨酰胺酶抑制剂 CB-839，以及研究中的氧化磷酸化抑制剂二甲双胍、IDH 和 FASN 靶向抑制剂等[47]，其中部分药物已在 OS 的临床试验中取得一定疗效[38,48-50]；除代谢酶和转运蛋白的直接抑制剂外，靶向肿瘤代谢相关的调节物也有潜在的治疗效果，如 S1PR3 拮抗剂 TY52156 可抑制 S1P / S1PR3 轴减少糖酵解酶 PGAM1 的转录[51]、生物提取物 honokiol 可促进 ROS / ERK1 / 2 通路上调葡萄糖调节蛋白 GRP-78 和 ROS 水平[52]，进而抑制 OS 细胞生长。因此，靶向代谢药物在 OS 的临床治疗方面具有良好的应用前景，但目前的研究多数仍处于机制水平，尚缺乏大量高级别有效证据，临床疗效证据不足，且部分受限于其安全性[53]。尽管靶向肿瘤代谢能够有效地抑制肿瘤的发生发展，但单一代谢通路抑制的治疗方法也存在某些缺陷，包括忽略了肿瘤的异质性和代谢适应现象，例如同一肿瘤组织中既有依赖无氧糖酵解的肿瘤细胞，也有依赖氧化磷酸化的肿瘤细胞；糖代谢途径被抑制的肿瘤可以转向依赖谷氨酰胺等其它代谢物质[54]。因此，未来靶向代谢治疗方案可能需要在针对肿瘤代谢特征的同时对多种代谢通路进行抑制，以在确保安全性的同时，获得对 OS 有特效的、更加理想的治疗效果[55]。