HLA DRB1∗0901多态性与常见过敏原致过敏反应易感性的关系

周道平 区宇洁 薛晓芳 郭菁 甄英鹏 陆伟桃 张玲 莫桂玲

1广州开发区医院（广州510730）；2广州金域医学检验中心有限公司（广州510320）

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）⁃DRB1*0901 位点（ rs2395185）位于HLA⁃DRB1 的配体结合口袋，是与生物活性相关的氨基酸残基。该位点已在多种疾病，如肺癌、淋巴瘤等的关联分析研究中被报道［1⁃3］，并且，有报道rs2395185 与tIgE 水平升高［4］、系统性红斑狼疮的抗核抗体阳性相关［5］。因此，该位点可能与机体自身免疫相关。但是，该位点与中国人群过敏性皮肤病的关系未见报道。本研究探讨rs2395185位点的多态性与广州地区居民19 种皮肤过敏原的关系，为今后过敏相关皮肤疾病的个性化治疗提供精准干预的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年11月至2021年4月广州开发区医院、广州市黄埔区红十字会医院皮肤科收治的过敏性皮肤病患者304 例，年龄2～81岁，平均年龄33.1 岁。其中男125 例，女179 例。患者均按《中国临床皮肤病学》相关标准诊断并确诊。患者的主要症状有荨麻疹、湿疹等。所有受试者均为2 周内未用皮质类固醇激素和3 d 内停用抗组织胺药的患者，排除合并慢性疾病或严重代谢性疾病、既往有皮肤病史的患者。受试者之间无直接亲属关系，本研究通过本院医学伦理委员会批准，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 血液过敏原检测 采集受试者外周血，分离血清1 mL，采用免疫印迹法检测过敏原，包括19种过敏原：户尘螨、屋尘、蟑螂、猫毛皮屑、狗毛皮屑、苋、混合草（肯塔基蓝草/草地羊茅/果园草/小糠草/黑麦草/梯牧草/黄花茅）、桑树、霉菌（点青霉/交链孢霉/烟曲霉/分枝孢霉）、树花粉（栎树/榆树/梧桐/柳树/杨树）、鸡蛋白、牛奶、牛肉、虾、蟹、贝、腰果、芒果、菠萝，检测仪器为phadia Immuno CAP250 过敏原检测系统（瑞典法玛西亚公司），检测试剂为过敏原特异性抗体IgE 检测试剂盒UniCAP（瑞典法玛西亚公司）。检测结果分为6级，0 级为不过敏（阴性），1 级为可疑或轻度过敏，2 级为轻度过敏，3 级为中度过敏，4 级为中到重度过敏，5 级以上为重度过敏。

1.3 HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位点检测 采用PCR 测序技术检测外周血HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位点。采集受试者外周静脉血5 mL，置于EDTA⁃Na2 抗凝管中，⁃80 ℃冰箱保存。采用全血DNA 纯化试剂盒HiPure FFPE DNA Kit（广州美基生物科技有限公司）进行DNA 提取，操作步骤严格按照说明书进行。PCR 引物和测序引物委托苏州泓迅生物科技股份有限公司进行合成，引物序列如下：PCR 上游引物0901⁃SNP⁃F1：5′⁃GTCCTGTGGCCCTCTGATATT⁃3′；PCR 下游引物0901⁃SNP⁃R1：5′⁃ATTGGATTGTTGGGGTTCACAAG⁃3′；测序引物：0901⁃SNP⁃SF：5′⁃TCCCTATTTCAA TAAGCAGCACCACC⁃3’。PCR 反应体系为：dNTP 2.5 μL，DNA 100 ng，0901⁃SNP⁃F1（10 μM）1 μL，0901⁃SNP⁃R1（10 μM）1 μL，2×Phanta Max Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）25 μL，ddH2O 补足到50 μL。PCR 条件为：预变性94 ℃3 min；变性94 ℃20 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃30 s，35 个循环；72 ℃5 min；12 ℃保存。PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分离后，按Gel Extraction Kit D2500 胶回收试剂盒（广州美基生物科技有限公司）说明书纯化。纯化的产物送测序公司进行测序鉴定rs2395185 基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件。验证HLA DRB1*0901（rs2395185）位点是否符合哈德⁃温伯格平衡，采用直接计数法统计各位点的基因型频率和等位基因频率，组间比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。计算显性模型、隐形模型、累积模型（共显型模型），方法如下：G 为野生型等位基因，显性模型：G/G 加G/T 基因型人数与T/T 基因型人数比较；隐性模型：G/G 与G/T 加T/T 基因型人数比较；累积模型：G/G、G/T 及T/T 基因型人数三者比较。

2 结果

2.1 19 种过敏原阳性患者基因多态性检测结果 304 例受试者中，rs2395185 G/G 基因型为150例（49.3%），G/T 基因型为128 例（42.1%），T/T 基因型为26 例（8.6%），最小基因频率T＝0.296。19 种过敏原中任一种检测阳性患者中，仅在户尘螨、鸡蛋白、混合草过敏原阳性患者中检出T/T 基因型。各种过敏原阳性患者基因多态性检测结果见表1。

表1 过敏原阳性患者rs2395185 基因多态性检测结果Tab.1 Gene polymorphism of rs2395185 in patients with positive allergen例（%）

2.2 rs2395185 基因型与3 种过敏原检测结果的关系分析 根据户尘螨、鸡蛋白、混合草3 种过敏原检测结果是否阳性，把患者分成两组，分析组间基因型分布及基因模型差异，结果见表2。rs2395185 位点基因型均符合哈德⁃温伯格平衡（PHWE＞0.05）。将T/T 基因型设为对照，G/G 基因型、G/T 基因型在户尘螨检测阳性的患者中频率均高于阴性患者，两组间的基因型分布差异有统计学意义（P< 0.05），遗传模型分析发现显性遗传模型（G/G+G/Tvs.T/T）差异有统计学意义（P<0.05），G 基因型可能与户尘螨过敏相关；G/G、G/T基因型携带可能是户尘螨过敏的危险因素（OR＝

表2 rs2395185 基因型与3 种过敏原检测结果的关系分析Tab.2 Relationship between genotype of rs2395185 and three kinds of allergens例（%）

2.940，95%CI：1.167～7.407；OR＝2.889，95%CI：1.136～7.348）。而鸡蛋白、混合草检测阳性患者与阴性患者的G/G、G/T 基因型分布差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 rs2395185 基因型与过敏原反应严重程度的关系 将过敏原检测结果分级为1、2 级的患者作为轻度过敏组，结果分级为3 级以上的患者作为中、重度过敏组，将T/T 基因型设为对照，G/T 基因型在两组间的基因型分布差异有统计学意义（P＝0.027），G/T 基因型可能是过敏原反应严重程度的危险因素（OR＝8.681，95%CI：1.077～69.989）；遗传模型分析发现隐性遗传模型（G/Gvs.G/T+T/T）差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

表3 rs2395185 基因型与过敏原反应严重程度的关系Tab.3 Relationship between genotype of rs2395185 and severity of allergic reaction例（%）

3 讨论

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因群是调控人体特异性免疫应答、决定疾病易感性个体差异的主要基因系统［6］，HLA 分子肽结合槽是由等位基因编码的，等位基因的多态性如果改变了结合槽的结构，HLA 分子肽和T 细胞的相互作用就会受到影响，从而控制了外源性及自身抗原免疫应答反应的特异性，使得不同的HLA 基因型对多种疾病的易感性不同［7⁃10］。

Ⅰ型超敏反应可引发过敏性疾病，与HLA⁃Ⅱ类基因多态性关系密切［11⁃13］。有学者认为HLA⁃Ⅱ类位点的基因可以调节环境中普通过敏原的IgE 免疫反应。研究表明HLA⁃ DRB1* 0701 与TCR A/D 等位基因对于调节IgE 的产生有协同作用。最早研究HLA 基因多态性的报道认为DRB1*1501（DR2）相关的单倍型与豚草花粉所引起的过敏反应有关。另外，也有报道表明HLA⁃DR 和HLA⁃DQ 等位基因与花粉过敏、食物过敏的易感相关［14⁃15］。关于食物过敏，有研究认为HLA⁃DRB1*08、HLA⁃DRB1*08/12 tyr 16 和HLA⁃DQB1*04 基因型与花生过敏有明显相关性［16⁃17］，HLA⁃DQ 基因的rs9271588 位点与小麦过敏有明显相关性［18］。

HLA DRB1*09：01（rs2395185）位于HLA ⁃DRB1 的配体结合口袋，是与HLA⁃DRB1 生物活性相关的氨基酸残基。该位点已在多种疾病的关联分析研究中被报道。WANG 等［1］对肺癌发生风险SNP 的研究发现，HLA⁃DRB1*09：01 与APOBEC3A表达增加和APOBEC 突变率升高相关。WANG等［2］采用前瞻性队列研究方法，探讨日常烹饪时间与单核苷酸多态性（SNPs）对肺癌发病率的联合影响，发现位于6p21.32 的rs2395185 和rs3817963与肺癌发病率显著相关；与携带rs2395185GG 或rs3817963TT 基因型、不烹饪的受试者相比，每天烹饪时间超过2 小时且携带rs2395185GT+TT 基因型的受试者患肺癌的风险增加2.48 倍。另外，KENNEDY 等［3］在非西班牙裔白人男性中报道rs2395185 多态性与儿童淋巴瘤发病风险有强关联。VINCE 等［4］在非洲人群中发现HLA⁃DRB1*09：01 与总IgE 水平升高相关。 TERAO 等［5］对于日本女性系统性红斑狼疮易感性的研究显示，rs2395185 的T 等位基因与抗核抗体（ANA）阳性显著相关。对于哮喘的全基因组关联研究显示rs2395185 的次要等位基因T 是哮喘的风险等位基因［19］，但也是溃疡性结肠炎的保护性等位基因［20］。因此，笔者推测rs2395185 位点可能与机体自身免疫相关。但是，该位点与中国人群过敏反应发病风险的相关性未见报道。

本研究对于广州地区居民的rs2395185 基因型进行了分析，结果表明，人群的最小等位基因频率（T＝0.296）和1000Genomes、HapMap（T＝0.293）基本一致，但是与韩国人群（T＝0.378）、中东卡塔尔人群（T＝0.356）等有一定差异，说明该位点的多态性存在一定的种族差异。本次研究统计数据显示，皮肤科就诊患者阳性率最高的过敏原为户尘螨、鸡蛋白、树花粉。对于皮肤科就诊患者过敏原发病风险与rs2395185 基因型关系分析结果显示，户尘螨过敏原检测结果阳性、阴性患者间rs2395185 的G/G 基因型、G/T 基因型分布差异具有统计学意义（P<0.05），与户尘螨过敏的发病风险可能有关。对三种遗传模型分析比较得出，G/G、G/T 基因型以显性遗传方式影响户尘螨过敏（P＝0.015），存在G/G、G/T 基因型的患者户尘螨过敏风险更高。而鸡蛋白、混合草检测阳性患者与阴性患者的G/G、G/T 基因型分布差异无统计学意义（P> 0.05），因此rs2395185 与这两种过敏原所致的过敏反应发病风险可能不相关。另外，对rs2395185 基因型与过敏原反应严重程度关系进行分析，结果显示轻度过敏与中重度过敏患者的G/T基因型在两组间的基因型分布差异具有统计学意义（P< 0.05），G/T 基因型可能是过敏原反应严重程度的危险因素。

综上所述，本研究在广州地区居民中，对于HLA DRB1*09：01（rs2395185）位点与19 种常见过敏原所致的皮肤过敏反应的关系进行了研究，该位点多见于对肺癌等疾病的研究，在免疫相关疾病中少见报道。结果表明，广州地区居民户尘螨皮肤过敏发病风险可能与rs2395185 位点G/G、G/T多态性有关；19 种过敏原过敏的严重程度可能与rs2395185 位点G/T 多态性有关。本课题的局限性在于：样本量有限，因此除了阳性率最高的户尘螨、鸡蛋白、树花粉外，其他各种过敏原检出的阳性病例较少、难以结合SNP 基因型进行分析；研究仅限于广州地区；未能收集更详细的临床症状数据；除了年龄、性别外，未能收集到如职业接触、生活环境等其他皮肤病相关致病因素的数据；未能检测更多种类的过敏原。后续研究将收集更多不同地区、不同职业、接触其他过敏原的人群样本，以验证该位点与皮肤过敏反应发生风险的关系是否具有地区及职业接触差异、该位点与其他过敏原是否有关。