泰山磐石散对流产模型大鼠母胎界面NF-κB、IL-1β、TNF-α表达情况的影响*

邹剑芬，冉添福，高愉婷，吴基纬，贾晶晶，钟鸿钰，江澍

1 福建中医药大学中西医结合研究院 福建福州 350122

2 福建中医药大学中西医结合学院 福建福州 350122

自然流产（spontaneous abortion，SA）被定义为妊娠20周前没有外部干预就发生的妊娠丢失[1]。SA是妊娠最常见的并发症之一，且病因复杂，尽管进行了多年的研究，仍然对医学构成挑战。SA的发病机制尚未完全阐明，研究发现炎性免疫反应在SA中起关键作用[2]。而核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化及多种炎症因子的释放在其病理机制中具有重要作用[3]。又有研究[4]显示，一些细胞因子如肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosis factor，TNF-α）、 白细胞介素1-β（interleukin-1β，IL-1β）等，能刺激NF-κB 信号通路激活，进一步增强细胞炎症反应和促进局部免疫功能失衡。因此，本研究通过注射溴隐亭造大鼠流产模型，观察泰山磐石散对流产模型大鼠母胎界面中NF-κB、IL-1β、TNF-α表达水平的影响，进一步探讨泰山磐石散防治SA的作用机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物 采用SPF级SD大鼠，雄性15只，雌性30只，9周龄，体重200～250g，购于上海斯莱克实验动物公司，合格证：18101000032，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。常规饲养于福建中医药大学SPF级实验动物中心，自由饮水摄食，温度（20±2）℃，湿度40%～60%，每日12h明暗环境。

1.2 药品与试剂 泰山磐石散：人参3g，黄芪6g，白术 6g，当归 3g，川芎 2g，白芍药 3g，熟地黄 3g，川续断 3g，黄芩 3g，炙甘草 2g，砂仁 1.5g，糯米 6g。将所有药物混合（除开砂仁），加入1000 mL自来水，浸泡30min，然后大火煮沸后文火再煮25min，加入研磨好的砂仁粉末继续煎煮5min，以双层纱布滤过，得药液；在药渣中再加入500 mL自来水，重复以上操作1次；2次药液合并后，水浴蒸发药液至41.5 mL，制成含生药量 1 g/mL 的药液，4℃保存。NF-κB p65、IL-1β、TNF-α抗体（美国Immunoway公司）；免疫组化试剂盒（中国江苏凯基生物技术股份有限公司）；溴隐亭（2.5mg/片，瑞士诺华制药有限公司）。

1.3 实验仪器 包埋机（德国MICROM公司）；半自动石蜡切片机（德国 MICROM公司）；生物组织烘片摊片机（中国孝感亚光医用电子技术公司）；显微镜用数码相机（日本Nikon公司）等。

2 实验方法

2.1 分组与给药 SD大鼠适应性喂养2周后，对雌性SD大鼠进行称重。将30只雌性SD大鼠按1﹕1比例和雄性SD大鼠合笼过夜配种，随机平均分为正常组、模型组和治疗组，于每日早晨观察雌性大鼠有无阴道栓脱落。当观察到雌鼠有阴道栓脱落时作为妊娠第1天。正常组于孕1～11d灌服生理盐水10 mL/kg/d，孕 6 ～ 8d 皮下注射 75% 乙醇 1 mL/kg/d（75%乙醇为溴隐亭的溶解剂）；模型组于孕1～11d灌服生理盐水10 mL/kg/d，孕6～8d皮下注射溴隐亭溶液1 mL/kg/d；治疗组于孕1～11d灌服中药泰山磐石散汤剂10 mL/kg/d，孕6～8d皮下注射溴隐亭溶液1 mL/kg/d。

2.2 动物处置 于妊娠的第12天，腹腔注射20%乌拉坦溶液（注射量为5 mL/kg）麻醉孕鼠后，迅速剖开腹腔，观察妊娠情况，剪取孕鼠的胚胎组织，将胚胎组织置于PBS缓冲液中洗涤，放入4%多聚甲醛固定保存。组织标本固定12～24 h后进行石蜡包埋。

2.3 方法 3组大鼠蜕膜组织母胎界面子宫侧蜕膜组织 NF-κB、IL-1β、TNF-α 表达分布情况 用免疫组织化学S-P法分析母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达分布情况，参照免疫组化试剂盒说明书操作。封片完成后将组织切片放到显微镜下观察，母胎界面子宫侧蜕膜细胞内出现棕黄色颗粒视为NF-κB、IL-1β、TNF-α表达。在母胎界面子宫侧蜕膜组织中随机选取5个等大面积区域，用图像分析软件 Image-Pro Plus 6.0 进行半定量分析，计算子宫侧的平均光密度，然后进行统计分析。平均光密度＝积分光密度／选择区域面积。

3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，2组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

结 果

1 3组孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB的表达

在正常组中，NF-κB主要在母胎界面子宫侧蜕膜细胞的胞质中表达且维持在较低的水平。与正常组相比，模型组中NF-κB在胞质和胞核中均有表达且表达明显升高；经泰山磐石散治疗后NF-κB表达明显下降，主要表达在胞质中。其中正常组和模型组比较，治疗组和模型组比较均具有显著差异（P<0.01）。见表1，图1。

图1 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB表达情况（×200）

表1 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB平均光密度比较（±s）

表1 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB平均光密度比较（±s）

组别 只数 平均光密度正常组 10 0.0638±0.0055 模型组 10 0.1099±0.0038治疗组 10 0.0674±0.0044

2 3组孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织IL-1β的表达

IL-1β主要在母胎界面子宫侧蜕膜细胞的胞质中表达。与正常组相比，模型组中IL-1β表达明显升高，治疗组较模型组明显下降。其中正常组和模型组比较，治疗组和模型组比较均具有显著差异（P<0.01）。见表2，图2。

图2 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织IL-1β表达情况（×200）

表2 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织IL-1β平均光密度比较（±s）

表2 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织IL-1β平均光密度比较（±s）

组别 只数 平均光密度正常组 10 0.0180±0.0013模型组 10 0.0552±0.0016治疗组 10 0.0201±0.0011

3 3组孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织TNF-α的表达

与正常组相比，模型组母胎界面子宫侧蜕膜组织TNF-α表达明显升高，治疗组较模型组明显下降。其中正常组和模型组比较，治疗组和模型组比较均具有显著差异（P<0.01）。见表3，图3。

图3 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织TNF-α表达情况（×200）

表3 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织TNF-α平均光密度比较（±s）

表3 孕鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织TNF-α平均光密度比较（±s）

组别 只数 平均光密度正常组 10 0.0137±0.0010模型组 10 0.0508±0.0012治疗组 10 0.0146±0.0011

讨 论

目前，对于SA的西医治疗尚缺乏安全有效的治疗方案。SA的发生发展与多种病理过程相关，其中NF-κB介导的炎症反应是其发生的关键环节。研究表明，NF-κB在妊娠过程中发挥着重要作用，不仅被认为是妊娠着床的重要调节因子，而且妊娠的成功维持依赖于对NF-κB的抑制[5]。一般情况下，NF-κB在胞质中处于失活状态，当细胞被刺激并经过复杂的信号转导后，被激活的NF-κB从胞质中迁移进入胞核内，调控炎症相关的靶基因的转录表达。IL-1β和TNF-α是促炎性细胞因子，且二者均能激活NF-κB，活化的NF-κB能够增加TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的转录水平[4]，而转录产物又可以反过来继续活化NF-κB，从而形成正反馈回路放大了炎症信号。在妊娠过程中，适量的TNF-α有利于细胞代谢及胚胎发育，但多数研究认为，它对妊娠是一种负性调节因子。过表达的TNF-α可导致免疫平衡失调，刺激炎症反应的发生，严重可造成流产[6]。IL-1β在生理浓度可促进卵泡生长，排卵和黄体的形成以及植入和胚胎发育[7]。但IL-1β也是炎症反应过程中重要的炎症介质，过表达的IL-1β可与其他细胞因子协同增强细胞毒性和炎性反应，影响胚胎发育[8]。因此，TNF-α和IL-1β两者可能相互促进，产生协同作用，引起母胎界面的过度免疫炎症反应。由此推测，抑制NF-κB的活化、降低促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达可能达到防治SA的目的。

本次免疫组化实验结果显示，与正常组孕鼠相比，模型组流产大鼠母胎界面中转录因子NF-κB和促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达均显著升高（P<0.01），且NF-κB在胞质和胞核中均有表达，表明流产大鼠母胎界面发生了NF-κB的活化及多种炎症因子的释放。与相关研究结果相符[9，10]，提示了SA的发生与母胎界面过度炎症免疫反应密切相关。与模型组相比，治疗组母胎界面中NF-κB、IL-1β和TNF-α的表达水平显著降低（P<0.01），且NF-κB核移位明显减少，表明泰山磐石散可能通过有效抑制NF-κB的活化，降低IL-1β和TNF-α等炎症因子的合成和释放，以达安胎的疗效。

中药保胎名方泰山磐石散源自徐春甫的《古今医统大全》，以八珍汤为基础方，去八珍之茯苓，加黄芪、黄芩、川续断、糯米、砂仁组成，具有益气健脾、养血补肾安胎之功。因茯苓有淡渗利湿之效，恐伤胎气，故弃之；黄芪、人参、白术、炙甘草同用共成益气健脾之功，且黄芪有升提的作用，故能举胎防堕以固胎元；配以四物汤（当归、熟地黄、川芎、白芍药）养血和血以滋养胎元；黄芩、川续断皆为安胎之要药，且黄芩清热之力较强，使诸药补而不滞，而川续断既善补肝肾、又能调血脉，与熟地黄合用，增强补益肝肾之功而保胎元；砂仁、糯米调气和胃。诸药合用使气血调，冲任固，胎元安。现代药理研究发现，上述中药中人参、黄芪、白术等具有调节免疫系统功能[11]；黄芩[12]、白芍[13]、炙甘草[14]等具有良好的抗炎作用。本此实验研究进一度证明，泰山磐石散具有一定的抗炎作用，可能通过调节母胎界面的过度炎症免疫反应，使胚胎能正常着床、发育。

综上所述，3组大鼠母胎界面中NF-κB、IL-1β、TNF-α均有表达。与正常妊娠组相比，模型组流产大鼠的母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达水平均明显增高（P<0.01），且NF-κB在胞质和胞核中均有表达；经泰山磐石散治疗后大鼠母胎界面子宫侧蜕膜组织NF-κB、IL-1β和TNF-α的表达水平均显著降低（P<0.01），且NF-κB核移位明显减少。因此，我们推测，泰山磐石散能够有效防治SA，可能是通过抑制NF-κB的活化、减少促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的合成和释放实现的。