lncRNAFOXD2-AS1靶向miR-185/SIX1轴对子宫内膜癌细胞增殖迁移及顺铂敏感性的影响

吴天玉，刘湘鄂,许 海

(1.荆州市第三人民医院 妇科,湖北 荆州434000；2.荆州市第三人民医院 泌尿外科,湖北 荆州434000;3.湖北中医药大学黄家湖医院 妇科,湖北 武汉430070)

顺铂是其主要化疗药物之一，克服耐药在子宫内膜癌临床治疗中至关重要。有研究报道，非编码RNA在子宫内膜癌细胞对紫杉醇[1-2]、卡铂[3]耐药机制中发挥重要作用，FOXD2-AS1与微小RNA(miR)-185-5p相互作用，调节结直肠癌细胞细胞的增殖，迁移和侵袭[4]。肌腱同源盒1蛋白 (SIX1)在子宫内膜中异常表达，是人类子宫内膜癌的生物标志物[5]。但lncRNAFOXD2-AS1在子宫内膜癌中的作用机制尚不清楚，探讨lncRNA FOXD2-AS1通过调控miR-185/SIX1分子轴参与子宫内膜癌细胞对顺铂敏感性的分子机制，为临床化疗耐药寻找新的治疗靶点和分子标志物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DDP(货号：P4394)、兔源单克隆SIX1抗体(货号：HPA001893)购自Sigma公司；BCA蛋白试剂盒(货号：354234)购自上海恒斐生物科技有限公司；GAPDH抗体(货号：ab181602)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号：ab205718)单抗均购自abcam公司；DMEM培养基(货号：10567014)购自Gibco公司；ECL化学发光试剂盒(货号：P0018S)购自碧云天生物技术有限公司；显微镜购自上海炳宇光学仪器有限公司；化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

人子宫内膜癌HEC-1-B细胞和正常子宫内膜HESC细胞均购自中科院上海细胞研究所，将HEC-1-B、HESC细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清)，在37℃、5% CO2恒温培养，当细胞融合80%左右时，用胰蛋白酶消化进行传代，细胞处于对数生长期进行后续实验。

1.3 子宫内膜癌DDP耐药细胞株[6]构建

取对数生长期的HEC-1-B细胞，调整浓度为1×107个/ml，DDP开始作用浓度为2 μmol/L，刺激48 h后，无显著死亡，DDP浓度按4、8、12、16、20、24 μmol/L逐步增加，最终在DDP 22 μmol/L下能够稳定生长，获得耐药细胞株HEC-1-B/DDP，并长期培养维持其耐药性。

1.4 qRT-PCR检测各组细胞中FOXD2-AS1、miR-185和SIX1表达水平

提取各组细胞中总RNA，进行反转录制备cDNA，以反转录产物为模板进行qPCR检测，用U6和GAPDH为内参，引物序列如表1所示。结果采用2-ΔΔCt法进行计算。

表1 引物序列

1.5 MTT法检测各组细胞活性及药物敏感性

取对数生长期的HEC-1-B、HEC-1-B/DDP细胞，调整浓度为1×105个/ml，接种至96孔板中，培养24 h，每孔设置6个平行孔，然后，每孔加入20 μL MMT，于37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育4 h后，每孔加入200 μL DMSO，用酶标仪测定在570 nm处的吸光值(A值)。

1.6 Transwell检测各组细胞迁移、侵袭能力

调整细胞浓度为2×105/mL接种于Transwell上室，下室加250 μl含10%胎牛血清的培养基，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h。取出小室，PBS冲洗后，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，冲洗干燥后于倒置显微镜下随机选取5个视野进行观察并计算迁移数。细胞侵袭能力检测：制备50 μL Matrigel胶(200-300 μg/mL)，铺在Transwell小室的上室于恒温培养箱过夜，待Matrigel胶凝固。

1.7 Western blot检测细胞中SIX1蛋白表达水平

提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒测其浓度，按蛋白30 μg /孔上样进行电泳分离、转膜、封闭后分别加入一抗(抗SIX1抗体，1∶1000)，4℃下过夜培养，次日加二抗(1∶5000)，温室中培养1 h，洗膜，ECL化学发光法进行显色，GAPDH用作内参，扫描胶片，Tanon 600图像分析系统分析条带灰度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 HEC-1-B/DDP细胞药物敏感性检测结果

DDP对HEC-1-B的IC50值为15.36±0.91 μmol/L，HEC-1-B/DDP的IC50值为112.42±10.05 μmol/L，HEC-1-B/DDP的RI值为7.32±0.52。HEC-1-B/DDP细胞耐药性良好，可用于后续实验，见表2。

表2 HEC-1-B/DDP细胞耐药敏感性检测结果

2.2 HESC、HEC-1-B及HEC-1-B/DDP细胞中FOXD2-AS1表达水平

与HESC组相比，HEC-1-B组细胞中FOXD2-AS1表达显著升高(P<0.05)；与HEC-1-B组相比，HEC-1-B/DDP组细胞中FOXD2-AS1表达显著升高(P<0.05)，见表3。

表3 HESC、HEC-1-B及HEC-1-B/DDP细胞中FOXD2-AS1表达水平

2.3 低表达FOXD2-AS1对HEC-1-B细胞活性、迁移、侵袭的影响

与si-con组相比，si-FOXD2-AS1组细胞FOXD2-AS1表达、迁移、侵袭显著降低(P<0.05)，细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)，见图1。

2.4 低表达FOXD2-AS1对HEC-1-B/DDP细胞药物敏感性的影响

与HEC-1-B/DDP组相比，si-FOXD2-AS1组细胞RI值显著降低(P<0.05)，见表4、5。

图1 各组HEC-1-B细胞迁移、侵袭结果图

表4 低表达FOXD2-AS1对HEC-1-B/DDP细胞药物敏感性的影响

表5 各组HEC-1-B/DDP细胞RI值比较结果

2.5 HEC-1-B细胞中FOXD2-AS1对miR-185表达的影响

与si-con组相比，si-FOXD2-AS1组miR-185表达显著升高(P<0.05)；与pcDNA组相比，pcDNA-FOXD2-AS1组miR-185表达显著降低(P<0.05)，见表6。

表6 HEC-1-B细胞中FOXD2-AS1对miR-185表达的影响

2.6 过表达miR-185对HEC-1-B细胞活性、迁移、侵袭的影响

与miR-con组相比，miR-185-5p组细胞中miR-185表达、细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，细胞迁移、侵袭数显著降低(P<0.05)，见图2。

图2 各组HEC-1-B细胞迁移、侵袭结果图

2.7 过表达miR-185对HEC-1-B/DDP细胞药物敏感性的影响

与HEC-1-B/DDP组相比，miR-185-5p组细胞RI值显著降低(P<0.05)，见表7、8。

表7 过表达miR-185对HEC-1-B/DDP细胞药物敏感性的影响

表8 各组HEC-1-B/DDP细胞RI值比较结果

2.8 HEC-1-B细胞中miR-185对SIX1表达的调控作用

与miR-con组相比，miR-185组细胞中SIX1 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)，见表9。

3 讨论

lncRNA在多种癌中失调与肿瘤的发生、转移和化学耐药性密切相关[7]。lncRNAFOXD2-AS1在非小细胞肺癌、喉癌等多种癌细胞中表达升高，参与癌细胞增殖、迁移和侵袭等过程[8-9]。研究发现，与HESC组相比，HEC-1-B组细胞中FOXD2-AS1表达显著升高，提示FOXD2-AS1与子宫内膜癌的发生密切相关。与si-con组相比，si-FOXD2-AS1组细胞FOXD2-AS1表达、迁移、侵袭显著降低，细胞增殖抑制率显著增加，提示抑制FOXD2-AS1表达可以抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭。与HEC-1-B组相比，HEC-1-B/DDP组细胞中FOXD2-AS1表达显著升高，提示FOXD2-AS1表达可能影响子宫内膜癌细胞对顺铂敏感性。而低表达FOXD2-AS1的HEC-1-B/DDP细胞的RI值较HEC-1-B/DDP细胞显著降低，提示FOXD2-AS1表达降低对HEC-1-B/DDP细胞药物耐药性减弱，敏感性增强。

表9 过表达miR-185对SIX1表达的影响

多种LncRNA对miRNA具有海绵吸附作用，共同参与肿瘤发生发展过程[10]。研究发现，与si-con组相比，si-FOXD2-AS1组miR-185表达显著升高，与pcDNA组相比，pcDNA-FOXD2-AS1组miR-185表达显著降低，提示在子宫内膜癌细胞中miR-185表达与FOXD2-AS1相关，Chen等[11]研究发现，敲低FOXD2-AS1，miR-185表达升高，抑制肝癌细胞增殖，侵袭和迁移。推测在子宫内膜癌细胞中FOXD2-AS1可以靶向作用于miR-185，影响细胞增殖、侵袭、迁移等生物学活性和对顺铂药物敏感性。

SIX1属于SIX转录因子家族，参与细胞生长、分化，SIX1在乳腺癌[12]、宫颈癌[13]等多种肿瘤细胞中异常表达且在癌细胞增殖、迁移、侵袭等过程中发挥重要作用。研究发现，与miR-con组相比，miR-185组细胞中细胞增殖抑制率显著升高，细胞迁移、侵袭数、SIX1 mRNA及蛋白表达显著降低，提示miR-185表达与SIX1 mRNA及蛋白表达趋势相反，其可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭。过表达miR-185组HEC-1-B/DDP的RI值较HEC-1-B/DDP细胞RI值显著降低，提示在子宫内膜癌细胞中，过表达miR-185靶向作用SIX1，细胞顺铂耐药性降低，敏感性升高。推测FOXD2-AS1可以通过调控miR-185/SIX1轴诱导子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭且影响细胞对顺铂敏感性。综上，FOXD2-AS1可通过下调miR-185-5p对SIX1的抑制作用，进而促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭作用，下调细胞对DDP的敏感性。