钙结合蛋白在健康牙周组织和实验性牙周炎组织的表达分布

郜洪宇，孟焕新，侯建霞，黄宝鑫，李 玮

(1.北京大学口腔医学院·口腔医院，牙周科 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，北京 100081； 2.天津医科大学口腔医院牙周科，天津 300070)

牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病，是成人牙丧失的主要原因，且严重危害全身健康[1]。近年来有关牙周炎发病机制的研究表明，宿主对致病菌感染过度的免疫炎症反应是造成牙周组织破坏的主要原因[2-3]。中性粒细胞是先天免疫系统的重要细胞，位居宿主对牙周致病菌的第一道防线。当牙周感染发生时，大量的中性粒细胞率先到达感染部位，释放多种生物活性酶及蛋白质，发挥抗菌功能，然而它们一旦过多地释放，就会对周围组织和细胞造成破坏，加重炎症反应[4]。牙龈上皮在控制微生物感染、保护皮下组织和维持牙周组织稳态方面具有非常重要的作用，不仅发挥抗微生物的物理屏障作用，而且通过表达多种模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)分泌多种细胞因子、趋化因子和抗菌肽，与病原微生物反应，在宿主免疫识别和启动方面发挥着主动的生物屏障作用，参与宿主的先天性免疫反应和获得性免疫反应[3,5]。

钙结合蛋白(S100A8/A9)由S100A8和S100A9组成，是中性粒细胞的主要胞浆蛋白，在牙龈上皮细胞、活化的单核巨噬细胞和血管内皮细胞也有表达或诱导表达[6]。大量流行病学证据表明，钙结合蛋白与牙周炎症程度、牙周治疗效果密切相关[7-10]。本课题组既往通过病例-对照研究、家系研究双向证实S100A8基因多态性与侵袭性牙周炎易感性相关[11-12]；同时，发现侵袭性牙周炎患者血浆中钙结合蛋白的水平显著高于牙周健康者，钙结合蛋白不仅与牙周临床参数呈正相关关系，而且与血液白细胞数目、中性粒细胞数和百分比、C 反应蛋白水平也呈显著正相关关系[13]，而龈沟液钙结合蛋白浓度是血浆浓度的1 000倍以上，其主要来源可能是局部浸润的中性粒细胞[14]。

要认识钙结合蛋白在牙周炎发生发展中的作用，首先必须明确在牙周健康和牙周炎症状态下，钙结合蛋白在牙周组织局部的表达分布、细胞定位和表达水平。但目前尚未见在牙周健康和炎症状态下，钙结合蛋白在牙周组织中表达的直接证据。早期的学者对钙结合蛋白在健康及炎症时牙周组织中的表达进行过研究，但所研究的组织结构不完整[15-16]。因此，本研究旨在对钙结合蛋白(S100A8/A9)在比格犬健康牙周组织、实验性牙周炎组织内的表达分布情况进行系统观察，明确其细胞定位,分析S100A8/A9的表达水平与炎症的关系,探讨S100A8/A9在牙周炎发生发展中可能发挥的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 牙周炎模型建立及组织标本处理

6只健康雄性纯种比格犬(北京玛斯生物技术有限公司提供)体质量10.0～12.5 kg，1～2岁龄。经全口龈上洁治后，随机选择一侧下颌第二磨牙用棉线结扎诱导牙周炎，另一侧用牙刷和0.12%(质量分数)氯己定溶液进行口腔卫生维护，每两天一次。比格犬于诱导第6周、第12周在全麻下使用UNC 15 mm牙周探针检测每颗牙近中、远中两个位点的探诊深度(probing depth，PD)， 拍摄X线片确认牙槽骨存在吸收。诱导第12周，解剖颈总动脉、颈静脉，过量麻醉药处死后，用4%(体积分数)多聚甲醛溶液(pH=7.4)行颈总动脉灌注固定20 min。解剖下颌骨并将组织放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。随后进行10%(质量分数)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)脱钙，冲洗、脱水、透明、浸蜡后包埋、连续5 μm切片、展片、烤片、备用。本研究动物实验开始前已经北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准(批准号：LA2010-032)。

1.2 免疫组织化学染色

组织切片经二甲苯、梯度乙醇溶液脱蜡至水，3%(质量分数)过氧化氢溶液室温下处理标本20 min， 0.17%(质量分数)胰蛋白酶溶液37 ℃消化20 min，切片表面滴加鼠抗狗/人S100A8+S100A9(Abcam，英国)一抗工作液，用与一抗相同浓度的小鼠正常非免疫血清代替一抗作为阴性对照，置于湿盒，4 ℃过夜；二抗采用PV-9002小鼠超敏两步法免疫组织化学试剂(中杉金桥，北京)，二氨基联苯胺(diaminodiphenyl, DAB)显色1～3 min，苏木素复染，梯度乙醇溶液(酒精)脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。采用BX51-DP72显微数字成像系统(Olympus，日本)拍照。

1.3 细胞培养

将北京大学口腔医院综合二科因正畸治疗需要新鲜拔除的无牙体牙髓根尖病变且无牙周疾病的牙体完整的前磨牙或第三磨牙，放入无菌取样管用于培养人原代牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)，同时将北京大学口腔医院牙周科门诊牙周手术切除的临床健康的人牙龈组织(牙龈色粉、质韧，龈缘菲薄紧贴牙面，探诊不出血)放入无菌取样管，用于培养人原代牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts，GFs)。本研究细胞培养开始前已经北京大学口腔医院伦理委员会审查批准(PKUSSIRB-2011007)。

1.4 免疫细胞化学染色

将4～8代的PDLCs、GFs以适宜密度接种至铺有无菌盖玻片的24孔板，5% (体积分数)CO2、饱和湿度的37 ℃培养箱中继续培养。细胞过夜贴壁后，去除培养基，以4%多聚甲醛常温固定20～30 min； 0.1% (质量分数)Triton X-100室温10 min，3%(质量分数)过氧化氢溶液室温下处理20 min。采用鼠抗狗/人S100A8+S100A9(Abcam，英国)一抗工作液，用与一抗相同浓度的小鼠正常非免疫血清代替一抗作为阴性对照，4 ℃过夜。二抗采用PV-9002小鼠超敏两步法免疫组织化学试剂(中杉金桥，北京)， DAB显色1～3 min，苏木素复染，梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。采用BX51-DP72显微数字成像系统(Olympus，日本)拍照。

2 结果

2.1 S100A8/A9在比格犬健康及牙周炎牙龈组织中的表达(图1)

根据课题组前期发表的研究所描述[17]，实验第12周时，结扎侧的临床表现、根尖片、HE染色结果均显示比格犬实验性牙周炎模型诱导成功。

在比格犬相对健康牙周组织中(图1A)，牙龈组织完整，包括表面上皮、沟内上皮、结合上皮和上皮下结缔组织，标本相对健康，仅有少量炎症细胞浸润。S100A8/A9主要表达于牙龈上皮和少量浸润的中性粒细胞。在牙龈上皮内，S100A8/A9均在结合上皮处表达最强(图1A3)，其次是表面上皮(图1A1)，在沟内上皮表达最弱(图1A2)。S100A8/A9的表达水平在结合上皮与沟内上皮的交界处差异明显。

A， the expressions of S100A8/A9 in relatively healthy gingiva (lower magnification); B， the expressions of S100A8/A9 in periodontitis gingiva (lower magnification); A1， the magnified A1 boxed area of A; A2， the magnified A2 boxed area of A; A3， the magnified A3 boxed area of A; A4， the magnified A4 boxed area of A; B1， the magnified B1 boxed area of B; B2, the magnified B2 boxed area of B; B3, the magnified B3 boxed area of B; B4, the magnified B4 boxed area of B, arrows show fibroblast-like cells expressing S100A8/A9; D, dentin; CT, connective tissue.图1 S100A8/A9在健康及实验性牙周炎牙龈组织中的表达分布Figure 1 The expression and distrubution of S100A8/A9 in gingival tissues of periodontal health and experimental periodontitis

在实验性牙周炎牙周组织的表面上皮中，上皮钉突增生，下方可见大量炎症细胞浸润，S100A8/A9在实验性牙周炎组的染色强度(图1B1)与健康牙周组织(图1A1)类似；实验性牙周炎牙周组织的沟内上皮糜烂溃疡，上皮细胞间可见大量浸润的炎症细胞，上皮细胞向结缔组织内增生呈条索状或网眼状，S100A8/A9呈强阳性表达(图1B2)，其染色强度与健康牙周组织(图1B1)相比明显增加；实验性牙周炎组织的结合上皮大部分破坏消失，残留部分上皮细胞S100A8/A9呈强阳性表达(图1B3)， 其染色强度与健康牙周组织(图1A3)相比明显增加。

在实验性牙周炎的牙龈结缔组织中，存在大量的炎症细胞浸润，中性粒细胞呈S100A8/A9强阳性表达，S100A8/A9在炎症细胞浸润区的成纤维样细胞呈弱阳性表达(图1B4)；而在健康牙龈结缔组织中，仅存在少量炎症细胞，S100A8/A9在牙龈成纤维细胞的表达呈阴性(图1A4)。

2.2 S100A8/A9在比格犬健康及牙周炎根分叉组织中的表达(图2)

在相对健康牙周组织的根分叉区中，仅存在少量炎症细胞浸润，牙槽嵴顶处未见骨吸收(图2A)，S100A8/A9在牙周膜细胞、血管内皮细胞的表达均为阴性(图2A1)；在实验性牙周炎的根分叉区中，存在大量炎症细胞浸润，其中中性粒细胞呈S100A8/A9强阳性表达(图2B)， S100A8/A9在炎症细胞浸润区下方的成纤维样细胞呈弱阳性表达，散在分布的毛细血管内皮细胞也呈S100A8/A9弱阳性表达(图2B1)。

在相对健康根分叉区的牙槽骨中，可见扁平的骨衬里细胞、脂肪细胞和纤维结缔组织的典型组织学结构，S100A8/A9染色均为阴性(图2A2)；在实验性牙周炎根分叉区的牙槽骨中，可见少量炎症细胞浸润，其中中性粒细胞S100A8/A9呈强阳性表达，骨髓腔中的成纤维细胞呈S100A8/A9弱阳性表达(图2B2)。

2.3 S100A8/A9在人牙龈成纤维细胞、人牙周膜细胞中的表达(图3)

为进一步证实牙龈结缔组织、根分叉区中，表达S100A8/A9的成纤维样细胞分别为牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞，采用免疫细胞化学法检测S100A8/A9在原代培养的人牙龈成纤维细胞、人牙周膜细胞中的表达。免疫细胞化学法结果显示原代人牙龈成纤维细胞、人牙周膜细胞均检测到S100A8/A9的表达(图3A、B)。

3 讨论

本研究在比格犬相对健康的牙周组织和实验性牙周炎的组织标本中系统观察了S100A8/A9的原位表达和分布特点：(1)在健康牙周组织中，S100A8/A9组成性表达于牙龈上皮细胞、中性粒细胞，在结合上皮处呈强阳性表达；在牙周炎组织中，沟内上皮细胞、残留结合上皮细胞的S100A8/A9表达水平上调，且牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞、微血管内皮细胞、骨髓成纤维细胞存在S100A8/A9的诱导表达；(2)在体外培养的人牙周膜细胞、牙龈成纤维细胞中检测到S100A8/A9的表达，进一步验证了牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞中S100A8/A9的表达。除了前期研究发现S100A8/A9的胞外功能外[18-19]，本研究发现S100A8/A9通过多种牙周组织细胞的胞内功能，可能参与牙周免疫炎症反应的调控机制。

牙龈上皮细胞是机体抵御病原菌入侵的重要防御体制，包括表面上皮、沟内上皮和结合上皮[5]。完整的沟内上皮和结合上皮构成了牙龈组织的结构性屏障，具有阻挡病原因子从口腔进入牙周支持组织的作用[5]。牙龈上皮除了被动地阻挡微生物的入侵之外，还能通过分泌抗菌肽、活性氧等多种机制主动地参与宿主先天性免疫炎症反应。研究显示[5]，结合上皮细胞能产生有效的抗菌物质，如防御素(defensins)和溶酶体酶等。本研究中比格犬健康牙龈上皮中的结合上皮S100A8/A9表达最强，其次是表面上皮、沟内上皮，提示结合上皮通过表达S100A8/A9在先天性免疫防御中发挥最强的抗菌能力。比格犬牙周炎症病损的牙周袋上皮糜烂溃疡，一旦表达S100A8/A9的结合上皮完整性被破坏，则宿主难以控制牙周感染。这些证据进一步证明完整的牙龈上皮不仅在牙周组织抗感染方面发挥了物理屏障作用，而且具有生物屏障作用。

与牙周健康组织相比，本研究的牙周炎症组织的沟内上皮、结合上皮S100A8/A9的表达水平上调，这与之前学者们发表的研究结果一致[15-16]，提示牙龈上皮细胞S100A8/A9的表达水平可能受微生物感染的调控，但其调控机制尚不清楚。Hiroshima等[20]研究发现，上皮细胞能够识别内毒素，产生并释放IL-1α，IL-1α可以上调邻近口腔上皮细胞中抗菌肽(包括S100A8/A9)的表达。因此，牙龈上皮细胞可能以自分泌、旁分泌的方式启动S100A8/A9依赖的先天性免疫炎症反应[21]。

A, the expressions of S100A8/A9 in the furcation tissues of periodontal health (lower magnification); B, the expressions of S100A8/A9 in the furcation tissues of periodontitis (lower magnification); A1, the magnified A1 boxed area of A; A2, the magnified A2 boxed area of A; B1, the magnified B1 boxed area of B; B2, the magnified B2 boxed area of B; arrows show fibroblast-like cells expressing S100A8/A9; D, dentin, ab, alveolar bone.图2 S100A8/A9在健康及实验性牙周炎根分叉组织中的表达分布Figure 2 The expression and distribution of S100A8/A9 in furcation tissues of periodontal health and experimental periodontitis

A, the expressions of S100A8/A9 in human gingival fibroblasts; B, the expressions of S100A8/A9 in human periodontal ligament cells; C, the negative control of human gingival fibroblasts; D, the negative control of periodontal ligament cells.图3 S100A8/A9在人牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞的表达Figure 3 The expression of S100A8/A9 in human gingival fibroblasts and human periodontal ligament cells

牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞分别是牙龈结缔组织、牙周膜组织的主要细胞成分，在对抗病原感染时，这些细胞表达模式识别受体、炎症细胞因子和趋化因子，从而具有某些免疫细胞的功能特点[22-23]。本研究发现牙周炎组的牙龈结缔组织、牙周膜组织中的成纤维样细胞表达S100A8/A9，并在体外培养的牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞中检测到S100A8/A9的表达。胞内S100A8/A9具有广谱抗菌活性，能够降低细菌的黏附和入侵，如S100A8/A9能抑制牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)的生长，抑制其黏附于牙龈上皮细胞[24]。本研究牙周炎组织的结合上皮破坏后，表达S100A8/A9的中性粒细胞、牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞和骨髓成纤维细胞形成一道屏障，可能起到防止病原微生物进一步向深层牙周组织入侵的作用。

本研究在牙周炎组织中的微血管内皮细胞检测到S100A8/A9的诱导表达，并可见中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞黏附于微血管内壁。Yen等[25]研究发现，LPS、IL-1β上调小鼠内皮细胞系S100A8、S100A9的表达。微血管内皮细胞来源的S100A8/A9可能通过增强炎症细胞迁移，招募炎症细胞至牙周局部，以对抗病原微生物的感染。

综上所述，S100A8/A9是牙周先天性免疫的重要防御装置，组成性表达于牙龈上皮细胞和中性粒细胞，维持牙周组织完整和内环境稳态。牙周炎引起S100A8/A9表达于牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞、微血管内皮细胞和骨髓成纤维细胞，并上调S100A8/A9在牙龈上皮细胞的表达水平，可能在牙周免疫炎症反应中发挥抗微生物感染、促炎症细胞迁移等作用。