斑花黄堇和条裂黄堇不同采集地区和部位的红外指纹图谱与特征分析

杜 清马 琴郭苏城 刘明地 吴 江 候永强 江 才赵 伟任 卓

（1.青海民族大学药学院，青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁810007； 2.青海民族大学实验设备管理中心，青海 西宁810007； 3.青海民族大学生态环境与资源学院，青海 西宁810007；4.青海民族大学化学与化工学院，青海 西宁810007）

斑花黄堇Corydalis conspersaMaxim.为罂粟科紫堇属多年生草本植物，产于甘肃西南部、青海中南部、四川西北及西部地区和西藏东部、中部等地，生于海拔3 800～5 700 m的多石河岸和高山砾石地［1］，始载于《西藏植物名录》［2］，又名广布紫堇［3］、密花黄堇［4］，藏语为“丁冬欧薷”，藏医全草作为“当日丝哇”使用［5］。《晶珠本草》 记载全草具有止渴、清热、治瘟病、各种热病和火烧伤，并可治胆病，是重要的寒性藏药材［6］。条裂黄堇CorydalislinarioidesMaxim.，产陕西、宁夏、甘肃、青海、四川、西藏，生于海拔2 100～4 700 m 的林下、林缘、灌丛下、草坡或石缝中［1］，又名铜棒锤（《陕西中草药》［7］、铜锤紫堇（《秦岭植物志》［8］）、藏药名甲打色尔娃［9］，藏医全草作为加达丝哇使用［5］，用于治疗胃病、肠炎、溃疡、肺痨、咳喘、伤寒、跌打损伤、筋骨痛、流行性感冒、坐骨神经痛、烧伤及各种传染病引起的血热症。确生等［10］对青海省斑花黄堇资源进行调查，并对其空间分布进行定量分析。

当前斑花黄堇在藏药部颁标准、藏药标准中有收载，40 多部藏医药经典中有记载，主要用作十八味党参丸、十味德哇散、三味群臣民散、十五味黑药肉毒方、七味瘟疫散、大红黑鹏丸、仁青常觉、色保芒宗等方剂的原料，其需求量大［10］。条裂黄堇味辛微苦，性平，有毒，两者在藏医中虽都作为“丝哇”类药材使用，但在《藏药志》 和古籍记载中与斑花黄堇性味功效差异较大［11］，而且两者从原植物形态特征有显著的区别，未见混淆使用的报道，需在今后详细研究2个品种不同功效的应用。研究中对2017年夏秋季节采集的斑花黄堇和条裂黄堇原植物和药材性状鉴定，应用红外光谱进行主成分和相关系数分析［12］，以期为斑花黄堇和条裂黄堇原植物、药材的识别、合理应用和资源保护提供参考。

1 材料

IRPrestige21 傅立叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）；YP⁃2 压片机（上海山岳科学仪器公司）；通风干燥箱（苏州贯觉电热设备有限公司）；干燥器（无锡德凡仪器有限公司）；玛瑙研钵及研杵（日本岛津公司）；电子天平（德国赛多利斯公司）。芦丁对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯）、溴化钾（光谱级，天津市博迪化工有限公司）。

药材于2017年8 月采于青海省海南州贵德县拉脊山、黄南州河南县托叶玛乡吉岗山、海北藏族自治州祁连县峨堡乡祁连山和玉树藏族自治州囊谦县着晓乡香龙峡谷山，经林鹏程教授、作者和原药材采集者对照标本及《中国植物志》 《青海植物志》 资料，确定为斑花黄堇和条裂黄堇，将新鲜植物样品各个部位清洗干净后，分成根、茎、叶、花各个部位，阴干，粉碎后过200 目筛备用。

2 方法与结果

2.1 样品信息 斑花黄堇（BHHJ）及条裂黄堇（TLHJ）样品信息见表1。

表1 斑花黄堇（BHHJ） 及条裂黄堇（TLHJ） 样品信息

2.2 斑花黄堇及条裂黄堇的药材特征

2.2.1 斑花黄堇根性状 根茎短，簇生棒状肉质须根，表面暗黄棕色。皱缩，具3～4 纵棱，质较硬，有柔性，断面较平整，具粉性，淡黄白色，中心木质部环状，颜色较深［4⁃6］。

2.2.2 条裂黄堇根性状 参考文献［9］，根纺锤形，表面暗黄棕色至黄褐色，皱缩，具纵棱，质较硬，断面较平整，具粉性，黄白色，中心木质部色较深。

2.3 条裂黄堇药材显微鉴别 参考文献［9］，根横切面呈多棱圆形。木栓细胞数列，扁长形，切向延长，壁略呈波状；栓内层为长椭圆形薄壁细胞，细胞内含极少量淀粉粒。韧皮部宽广，薄壁细胞充满淀粉粒，木质部小，由导管、木薄壁细胞组成，中心无髓［4⁃6］。

2.4 溴化钾和2种样品红外薄片制备

2.4.1 溴化钾和样品干燥 先分别精密称取1.670 0 g KBr、样品粉末0.100 0 g，按2015年版《中国药典》 中水分测定的方法，在105 ℃干燥3～4 h 至恒定质量。

2.4.2 空白KBr 红外薄片制备 取约200 mg 空白KBr 于玛瑙研钵中在红外烘灯下边烘边研磨。取出模具，准确套上模膛，放好垫片，将制好的样品均匀的抖入模膛内，装好模具后，将模具放在压片机上，在低真空下用9.81 GPa 的压力，经1～2 min 压成KBr 透明薄片，将其放在干燥器中待扫描检测。

2.4.3 红外样品制备 采用2种方法制备红外样品，第一种取1～2 mg 样品粉末，第二种称取样品粉末各0.01 g 后放入无水乙醇0.1 mL 充分研磨并浸渍提取上清液，将以上样品粉末和样品提取上清液，各加入150 mg KBr 于玛瑙研钵中研磨后挥干无水乙醇，按照对照品制备的方法压制成KBr透明样品薄片，保存在干燥器中待干燥后扫描检测。

2.5 红外检测条件 室温（21±5）℃左右，湿度≤65%即可开机，打开电脑，打开仪器操作软件IRsolution 快捷键，运行“采集→实验设置”菜单，测量方式选择透光率，设置扫描次数18 次，以其平均值作为样品红外信号数据，分辨率4 cm－1，扫描范围4 000～400 cm－1，扫描速度2.8 mm·sec－1，输入文件名，保存为参数文件。

2.6 红外光谱检测及保存 将以上制备好的空白KBr 及样品薄片，于红外分光光度计4 000～400 cm－1扫描测定，以其平均值作为样品红外信号数据。输入文件名储存谱图，对光谱图进行峰值检测、基线校正及谱图检索并打印。

2.7 数据处理分析方法 应用岛津IRPrestige21 红外光谱仪的数据分析软件IRsolution Chinese 进行红外光谱、共有模式峰标识及二阶导数处理；应用SPSS 20.0 软件统计各样品的相关系数和主成分特征情况。

2.8 红外光谱特征及结果分析

2.8.1 不同部位红外光谱特征图1 可知，红外光谱图中峰形状、峰位置均比较相似。参考文献［13⁃18］，对图2中主要的红外吸收峰进行指认和归属，见表2。3 572、3 549、3 525、3 502、3 491、3 468、3 448、3 406、3 390、3 360、3 224、3 028、3 024 cm－1为羟基O⁃H 伸缩振动吸收峰；2 916、2 850 cm－1为亚甲基C⁃H 反对称伸缩振动峰；1 747、1 735、1 701 cm－1为C＝O 伸缩振动峰，可能为酮酯类成分；1 635、1 631、1 627 cm－1为黄酮类成分的共轭羰基的伸缩振动；1 539、1 508、1 496 cm－1为芳香族化合物中苯环骨架伸缩振动吸收峰；1 458、1 435、1 431 cm－1为⁃OH伸缩振动吸收峰；1 373、1 369、1 319、1 315 cm－1为甲基的弯曲振动吸收峰；1 292、1 242、1 238 cm－1为酮的面内摇摆、酯类C⁃O⁃C 的伸缩振动峰和醚键的伸缩振动吸收峰；1 153、1 045、1 022 cm－1为糖苷类的C⁃O 的伸缩振动吸收峰；1 014 cm－1为邻位羟基C⁃O 键吸收峰；991、983 cm－1为糖环的振动吸收峰；808、771、763 cm－1为苯环取代C⁃H 面外弯曲振动吸收峰。以上的光谱特征综合反映出斑花黄堇中可能含有黄酮、生物碱、多糖及苷、酯类、芳香类等化学成分，与文献［18］中的结论部分是一致的，芦丁分子主要官能团红外吸收峰［13⁃14］分别为羰基υC＝O1 656.85 cm－1；苯环骨架 振动频率υC＝C1 600.92 cm－1，1 571.99 cm－1，1 504.48 cm－1，1 454.33 cm－1；羟 基υ⁃OH3 390.86 cm－1，由此表明斑花黄堇中会含有芦丁、5⁃羟基⁃7⁃甲氧基黄烷酮、2′，4′⁃二羟基双氢查耳酮等黄酮类成分［19⁃21］。同为罂粟科紫堇属植物，表明斑花黄堇和条裂黄堇根茎中的化学成分相近或相同，查阅研究文献，条裂黄堇还未有该方面的研究报道，故当前从原植物和药材性状、显微特征予以区别，今后通过传统化学成分分离和定性定量方法更进一步区分和鉴别二者。

表2 青海海南州采集的斑花黄堇和条裂黄堇药材粉末样品主要红外吸收峰及其指认辨别

图1 各样品红外光谱图

2.8.2 红外光谱特征及共有峰情况 由图2 可知，青海海南州采集的斑花黄堇根、茎、叶和花的红外光谱图峰形状、峰位置均比较相似，但吸收峰的相对强度有差异。根据图2～3 中的峰位和红外光谱数据，可看出主要的红外吸收峰相似或相近，可明确斑花黄堇和条裂黄堇中的共有峰有13个，主要在3 600～3 000 cm－1，2 916～2 850 cm－1，1 747，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 238，1 045，1 014，960，771 cm－1附近都有吸收峰。

图2 斑花黄堇茎、花、根、叶粉末红外光谱图

2.8.3 17 批样品红外光谱测定分析 由图3 可知，17 批斑花黄堇和条裂黄堇不同组织粉末样品均在3 600～3 000 cm－1，2 916～2 850 cm－1，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 242，1 045，960，864，771 cm－1附近都有吸收峰，表明斑花黄堇和条裂黄堇均含有具有特征峰的黄酮、多糖及苷、酯类、芳香类等化学成分。

图3 17 批不同组织样品红外光谱图

2.8.4 17 批样品红外光谱二阶导数分析 红外光谱二阶导数能有效提高红外谱图的分辨率，吸收峰的尖锐程度增大，带宽减少，扩大谱图间的差异。图4 是17 批样品红外光谱的二阶导数全图。从图中可以看出，5号（吉岗山的根）、8号（吉岗山的花）图谱峰数量偏少且峰强度偏弱，表明某些成分含量偏低或很少。6号（吉岗山的茎）、7号（吉岗山的叶）图谱峰数量偏多且峰强度较强，尤其是1 530～1 400 cm－1附近有较强的吸收峰，表明吉岗山茎叶中含有带羟基的芳香族或木质素类，也可能是黄酮类化合物。该方面需要结合药材生长的生态环境以及生长的年限等情况具体分析，其他样品二阶导数图谱峰数量差别不大，但峰强度有一定差别。

图4 17 批样品红外光谱二阶导数图谱

2.8.5 无水乙醇处理后红外图谱比较分析 由图1、4～6，用IR solution 软件，分析无水乙醇处理斑花黄堇（12～15号）和条裂黄堇（16～17号）粉末前后的红外光谱图谱和红外光谱二阶导数图谱［22］，发现无水乙醇处理后的样品图谱3 600～3 000 cm－1和1800～800 cm－1的峰强度下降，峰数目减少，尤其3 600～3 000 cm－1间的峰振动减少，表明无水乙醇处理后⁃OH 键可能断裂，且芳香族化合物1 600～1 450 cm－1、1 000～750 cm－1间的特征峰也减少且减弱，表明无水乙醇处理后，斑花黄堇（12～15号）和条裂黄堇（16～17号）粉末的原来各种成分含量和比例都产生了相应变化。

图5 各样品粉末无水乙醇处理前后红外光谱图谱

图6 各样品粉末无水乙醇处理前后红外光谱二阶导数

2.8.6 红外图谱的相关系数 以表1 中样品1 为药材的参照图谱，在波数4 000～400 cm－1计算17 批药材粉末样品红外光谱图中各点吸光度的相关系数分别为1、0.962 4、0.967 9、0.996 6、0.913 4、0.961 4、0.990 4、0.668 0、0.985 7、0.984 9、0.965 6、0.996 8、0.980 5、0.996 8、0.878 7、0.996 9、0.996 5。可知，17个斑花黄堇和条裂黄堇样品的红外光谱相关系数在0.668 0～0.996 9 之间，1号、5号和9号为斑花黄堇不同采集地区的根，8号和15号为斑花黄堇不同采集地区的花，与1号根部的相关系数较低，表明不同采集地区的根部和花部药材中的主要成分有一定的差异性。而其他采集地区和采集部位的红外光谱相关系数在0.96 以上，表明其化学成分相似。

2.8.7 主成分分析特征 选择斑花黄堇和条裂黄堇红外指纹图谱中的13个共有峰及其透光率值，通过SPSS 20.0 软件进行主成分和因子分析，并做成分特征值的碎石图和得分图，结果见图7～8，由图7 可知成分1 和成分2 为2个主成分，2个成分的积累贡献率为96.5%，由成分得分系数矩阵，可知主成分的红外波数特征在3 448，3 406，1 627 cm－1，与黄酮类及含有羰基、羟基基团结构的化学成分特征相符合。从图8 可看出17 批样品中所含有的2个特征性成分，其中主成分1 的特征吸收峰在2 916～2 850 cm－1，1 747，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 238，1 045，1 014，960，771 cm－1附近都有吸收峰；主成分2 的特征吸收峰在3 600～3 000 cm－1之间。

图7 17 批样品主成分特征值的碎石图

图8 17 批样品主成分得分图

2.8.8 主成分散点图 将斑花黄堇和条裂黄堇红外指纹图谱中的13个共有峰及其透光率值，通过SPSS 20.0 软件构建主成分散点图，见图9。

由图9 中可得出不同采集地区斑花黄堇和条裂黄堇根、茎、叶、花各个组织中的2种特征性成分的分布情况，其中玉树州囊谦县采集的斑花黄堇样品（样品12～15号）含有的2 类特征性成分，黄南州采集的斑花黄堇含有1 和2 类特征性成分（样品5号），海南州和海北州采集的斑花黄堇和黄南州采集的条裂黄堇样品中主要含有1 类特征性成分。

图9 17 批不同样品2个主成分分布散点图

3 讨论

本实验研究了17 批采集不同产地和不同组织部位的斑花黄堇和条裂黄堇的原植物、药材性状鉴定以及红外光谱特征，在样品采集和处理中细致地清洗各个组织部位的泥沙等杂质，保证各个药用部位的独立和干净，消除植物来源的背景和干扰。

斑花黄堇叶片轮廓长圆形，二回羽状全裂，小裂片条形或长椭圆形，灰绿色；而条裂黄堇叶片羽状全裂，裂片长条形，从植物形态有明显的区别。应用红外光谱仪检测药材中的光谱峰并鉴别特征区（3 600～1 500 cm－1）和指纹区（1 500～700 cm－1）［23］，鉴定了13个共有特征峰并比较其二阶导数的光谱特征，不同地区特征峰的强度及相关系数不同，尤其是不同部位，根和花中相关系数低，表明其特征性化学成分性质或含量有差异，而无水乙醇处理药材粉末后，红外光谱中峰强度下降，峰数目减少，表明化学成分有变化，也可能是无水乙醇提取出的化学成分有限，只鉴定了药材中的部分成分。

采集的均是斑花黄堇和条裂黄堇的野生植物，因各个采集地区的生态环境不同也会影响药材中有效成分的含量和质量，青海省各个野生采集地区的平均海拔在3 500 m 以上，地形复杂，主要有高寒性气候、高原大陆性气候、日照长且多，太阳辐射强，光能丰富，有利于植物的生长和发育，不同采集地区和组织部位的药材红外指纹图谱总体相似度很高，但含量有差异，尤其是根和花、茎、叶之间，表明化学成分受气候条件与生长环境的影响，研究中通过红外光谱指纹图谱结合统计学的分析，以期为今后更加深入鉴别斑花黄堇和条裂黄堇的异同、真伪和品质评价提供快速、有效的方法和参考依据。