中药复方口服制剂肠吸收评价方法研究进展

周 悦马丽霞陈 军董 洁顾 薇潘金火严国俊

（南京中医药大学药学院，江苏 南京210023）

近年来，以临床效应为导向的中药复方制剂质量控制和评价越来越受到关注，其影响因素众多，除了具有复杂的化学成分外，体内吸收代谢等过程也很重要。口服制剂通过胃肠道上皮细胞膜的转运进入血液循环，小肠作为药物吸收的主要部位，肠上皮细胞、肠内酶对药物的代谢及屏障作用、药物对小肠上皮中多种转运系统的特异性等均影响其生物利用度［1］。

目前，关于中药口服制剂肠吸收的研究仍以指标性成分含量居多，但该方法忽略了中药成分复杂、多环节、多靶点的特征，不具有整体性和科学性。本文总结了中药复方制剂肠吸收评价的常用方法（如体内法、在体法、体外法等），遵循了中医药整体观思想，以期探寻能体现其整体效应的肠吸收评价方法。

1 中药肠吸收实验方法

1.1 体内法 体内法是以整体动物为研究对象，口服给药后在规定时间内采集生物样品血液或尿液等，测定药液浓度，进行药动学研究，包括血药浓度法、药理效应法、毒理效应法、微生物测定法等［2］，以血药浓度法较常用，适用于已知活性成分的中药单体药动学研究，如赵文龙等［3］采用LC⁃MS／MS 法测定分别灌胃给予大鼠苍柏纳米乳、苍术黄柏提取物混悬液后血浆样品中盐酸小檗碱浓度。虽然体内法能提供药物口服吸收后的真实体内环境，但由于它综合了生理、物化、剂型等众多原因，不能特异反映肠道对药物的吸收，而且动物个体差异大，影响因素多，实验操作周期长，导致很少应用于药物吸收机制研究。

1.2 在体法 在体法包括体肠灌流法、肠襻法、肠道血管插管法等［4］，在整体动物建立的基础上保证肠道神经、内分泌调节完整性，也保证了血液、淋巴液供应，与体内法相比，其干扰因素大大减小，能观察药物在真实肠环境下的吸收水平。其中，体肠灌流法应用较广泛，根据灌流方式不同可分为循环灌流法、单向灌流法、振动灌流法等［5］，基本操作方法是将实验动物麻醉后开腹，在神经、血管不切断的条件下肠腔插管，洗净内容物，插管与恒流泵连接以使药液在肠腔内灌流，但它对药物吸收率的测定较困难，由于在灌流过程中肠道不仅会吸收药物，也会吸收或分泌水分，故需要对灌流液体积和密度进行校正，常用校正方法主要有标示物法、重量法，由于前者容易带来实验误差，故目前大多采用后者。

1.3 体外法 常用的体外法有外翻肠囊法、体外扩散池法、细胞模型法、平行人工膜渗透模型（PAMPA）等，操作方法是剥离出动物肠黏膜／肠段，或采用培养的细胞模型／仿生膜模拟肠环境对药物进行肠吸收评价。通常，先利用体外法考察药物的吸收部位与吸收机制。

1.3.1 外翻肠囊法 外翻肠囊法是将禁食12 h（自由饮水）的小鼠处死后选取所需肠段洗净，剥去多余脂肪组织，肠段一端系在玻璃棒上，翻转后使之成囊状结扎另一端，放入缓冲液一段时间后加入药物，于不同时间点从肠囊内取样测定。陈宝婷等［6］建立大鼠肠外翻模型后，采用UPLC 法测定不同时间点芒果苷在肠囊内的浓度，考察该成分在肠段中的最佳吸收部位，研究知母、知母⁃黄柏、P⁃糖蛋白抑制剂对其吸收的影响；孔小强等［7］采用外翻肠囊模型，对黄芪⁃附子配伍对附子6种生物碱肠吸收的影响进行研究，发现黄芪可抑制附子生物碱的吸收，而且其抑制作用与配伍比例、生物碱种类、肠段部位有关。该方法药液用量少，药物积累快，操作简便，实验结果易控制，但没有神经和血液的供应，导致肠囊会因离体时间太长而失去活性，而且在翻转肠段的过程中易造成细胞形态发生改变而影响肠段通透性，实验中也应注意控制时长。

1.3.2 细胞模型法细胞模型法是一种在细胞或分子层面上研究肠吸收的模型，主要有Caco⁃2、HT29⁃MTX、MDCK细胞模型，以Caco⁃2细胞模型应用更广泛，它来源于人类结肠癌细胞系，在细胞培养转运板（Transwell）培养中可分化成与人成熟小肠上皮相类似的单层细胞，并且含有小肠上皮相关的酶，能模拟小肠上皮细胞吸收转运过程，其建立需要经过细胞的培养和评价，包括形态学观察、跨膜电阻值（TEER）测定、稳定性考察、通透性验证等［8⁃10］。胡强等［11］采用Caco⁃2细胞模型研究四制香附主成分在肠吸收机制，可为相关临床应用和剂型设计提供参考依据；周本宏等［12］建立Caco⁃2细胞模型，研究时间、温度、pH值、P⁃糖蛋白抑制剂（维拉帕米和环孢菌素）对安石榴苷吸收转运的影响。Caco⁃2细胞来源于人体，同源性好，相比于动物模型更易操作，重复性更高，但该方法也存在缺点，如培养时间长、成本高、易污染等，而且Caco⁃2 作为单层细胞缺少主要吸收屏障之一的黏膜层，也缺少小肠上皮细胞特定的转运体和代谢酶。目前，将Caco⁃2 与其他细胞如产生黏液HT29⁃MTX 共同培养，从而优化了肠屏障建立［13］。

1.3.3 平行人工膜渗透模型（PAMPA）将含有卵磷脂的惰性有机溶液涂布在聚偏氟乙烯或者聚碳酸脂膜上，卵磷脂能在96 孔微滴板中形成非常稳定的双层膜，利用这种在支撑材料上成膜的性质建立了PAMPA 模型，用于模拟口服药物在胃肠道中的被动扩散吸收情况［14］。韩旻等［15］将PAMPA 模型和大鼠体内肠吸收模型进行比较，研究三七总皂苷油包水微乳体内药动学及体外对膜流动性和药物膜转运性质的影响。该模型具有高通量、低成本、检测手段方便、灵活性高等优点，是药物生物膜吸收的理想模型，但它只有单一的被动扩散机制，无法精确预测主动转运机制，对亲脂性的小分子化合物无法明确是由旁细胞渗透途径，还是被动扩散途径穿过细胞膜。目前，将PAMPA 与Caco⁃2细胞、MDCK细胞模型联用，可避免以上问题［16］。

1.3.4 体外扩散池法 体外扩散池法具有实验方法简单、易操作等优势，在研究药物肠吸收和代谢方面有着广泛应用，其基本操作方法是将分离出来肠段或肠黏膜夹在扩散池中间，加入适量缓冲液，通入空气进行搅拌或利用电磁搅拌药液，供应室投放药液，药液透过肠膜在接受室中收集，在不同时间段取样检测药物的累积量［17］。扩散池依据结构特征，有水平、垂直2种［18］，国内外有利用垂直扩散池（Franz）研究药物的透皮吸收能力［19］和肠吸收的机制［20⁃21］，因其操作简单，更为经济，可作为替代Caco⁃2细胞的肠吸收试验方法［22］；水平扩散池在市面上有Valia⁃Chien 扩散池或side⁃bi⁃side 扩散池，目前主要研究药物的透皮吸收能力，如口腔给药［23］、眼部给药［24］等，也可进行药物肠吸收实验［25⁃26］或与Caco⁃2细胞模型联用［27⁃28］。

尤斯灌流室法（Ussing Chamber）是另一种体外扩散池法，具有灌流室和电路系的特殊结构，首先是由丹麦学者Hans H.Ussing 研究上皮组织离子主动转运而建立的，之后在药学、畜禽营养、生理学等领域得到越来越广泛运用［29⁃30］，该系统主要由两部分构成，即灌流室、电路系统，具有2种灌流方式，即循环式、持续式。Wang 等［31］利用尤斯灌流室法，对黄芩和虎杖经肠吸收后的活性黄酮类化合物进 行筛选和测定；赵博欣等［32］采 用Ussing Chamber 扩散池，研究芹菜素与柏皮素分别经大鼠空肠、回肠与结肠黏膜的吸收情况。与上述2种扩散池法相比，尤斯灌流室法的优点为①研发出各种尺寸的样本夹，如大、小鼠肠段，皮肤或固定细胞培养插件等；②仪器设备齐全，电路系统可测定肠黏膜的跨上皮电压（transepi⁃thelial voltage，Vt）、短路电流（short⁃circuit current，Isc）、组织阻抗（resistance，Rt）等，可反映组织活性，如当肠黏膜的Vt＜4 mV 时，则被认为是活性弱的组织，表示实验结果不可靠；③U 形管可以保证两侧相同的流体静压，从而避免弯曲损坏组织［33］。具体装置［34］见图1。

图1 尤斯灌流室法装置图

2 中药复方口服制剂肠吸收评价方法

2.1 以化学成分为指标 由于中药单味药、复方成分复杂，与药效之间的关系尚不明确，目前仍普遍采用1种或几种化学成分作为单味药或全方的代表来开展肠吸收及药动学的研究，常用分析手段有紫外分光光度法、HPLC 法，或与HPLC 法联用，如HPLC⁃UV、HPLC⁃DAD、HPLC⁃ELSD 法等。柏希慧等［35］采用HPLC 法测定在体单向灌流液中薯蓣皂苷含量，分别考察不同肠段、药物浓度、P⁃糖蛋白（P⁃gp）抑制剂对该成分吸收的影响；刘亚楠等［21］采用Franz 扩散池法进行参附提取液体外渗透实验，以人参皂苷、人参附子总多糖含量为指标，通过紫外分光光度法测定参附提取液经不同肠黏膜的透过率；许永崧等［36］采用HPLC⁃DAD 法对吴茱萸汤及外翻肠囊吸收样品中9种成分进行定量、半定量分析，得到各成分在吴茱萸汤中的含量及在肠囊中的累积吸收量。但上述方法不具有专属性，忽略了中药成分复杂、多环节、多靶点的特征，选取的“指标”不一定是其专属性成分，也不一定代表有效成分，不能从整体水平上评价中药肠吸收的情况。

2.2 以指纹图谱为指标 中药指纹图谱作为一种半定量的中药质量评价手段，具有整体性和模糊性，在某种程度上符合中药多组分、多靶点的临床治疗特点，较单一成分的指标评价方法相比更具有全面性和科学性。李和伟等［37］采用离体大鼠翻转肠囊法对鸭跖草进行肠吸收实验，以HPLC法构建化学成分指纹图谱，并与原药液成分图谱直接比照，进行肠吸收成分定性指认，作为后续吸收定量评价的成分锁定基础。但指纹图谱会受色谱条件、化合物自身稳定性、多组分在同一条件下适应性等因素的影响，而且它虽然在一定程度上可表征中药质量，但本质上仍使用单一分析方法和检测手段，所得到的化学信息也是有限的［38］，并且所得整体化学成分的指标与生物等效、临床等效有无相关性还需验证。

2.3 以生物效应为指标 生物效应评价法是继性状评价、化学评价之后，推动中药质量标准走进临床、关联疗效的有效途径和手段，该方法是以药物生物效应为基础，利用整体动物、离体组织、器官、微生物和细胞、相关生物因子等为试验系，评价药物有效性或毒性等生物活性，从而达到控制或评价药物质量的目的［38］。该方法特别适用于结构复杂或理化方法不能测定其含量，或者理化测定不能反映其临床生物活性的药物，具有较强的专属性，直接关联中药有效性与安全性，简单快速，符合中药物质基础研究现状，在中药质量控制和评价中具有独特的优势，目前已在活血化瘀、宣肺平喘、抑菌、抗炎类等中药质量控制中得到广泛应用［39］。中药作为多成分化合物的集合体，其吸收行为和规律各异，若只依据一种或多种化学成分进行肠吸收研究，则无法综合评价中药复方吸收特征，而生物效应评价法可在不以化学成分为目标的基础上从整体出发，对中药复方口服制剂进行肠吸收机制评价，形成能反映中药整体吸收规律的生物学综合评价方法。将中药肠吸收药液作为化合物集合体直接作用于生物模型上时，产生一系列的相互作用过程，可形成可量化的生物效应指标值，从而获得生物效应值⁃吸收时间曲线，即可通过建立吸收动力学模型来探讨肠吸收机制，以此建立以生物活性为导向的中药口服制剂肠吸收机制评价方法，从而弥补化学成分评价方法的缺陷。

目前，已有将体外肠道吸收与生物活性相结合的研究。黄斌等［40］采用外翻肠囊法制备元胡止痛方不同时间点的肠吸收液探究对大鼠离体胸主动脉环张力的影响，发现血管舒张活性随着肠吸收的时间明显增强，并呈现出量⁃效、时⁃效关系；耿亚等［41］建立“肠外翻⁃心肌细胞”联用模型探究益气活血方肠吸收液的药效作用及机制，发现它对H9C2心肌细胞损伤具有较好的保护作用，并随着肠吸收液质量浓度增加细胞活力会增强，存在一定剂量依赖性。

口服固体制剂需先经过崩解、溶解成药液后才能在胃肠段进行吸收，溶出与吸收的方法虽然不一样，但评价指标和检测技术可以相互借鉴，目前已经有基于“量⁃效”相关性对中药复方进行体外溶出度生物效应评价的研究［42⁃43］。马晓斐等［43］基于细胞生物电传感效应对复方丹参片溶出动力学进行考察，采用实时电子分析技术（real⁃time cell⁃based assay，RTCA）监测加入不同时间溶出药液的H9C2心肌细胞动态变化（包括细胞增殖与分化、凋亡与衰老、黏附等多种细胞生理状态），将电信号转换成可定量的细胞指数（cell index，CI）以间接反映药物对细胞的作用，并以此为依据评价药物的生物活性，获得复方丹参片的细胞指数⁃溶出时间曲线，发现与利用紫外分光光度法检测得到的溶出度结果有较高相关性，与Weibull 模型相比，RTCA拟合的模型效果更佳。在建立体外肠吸收模型的基础上，获得中药复方制剂的肠吸收药液，应用RTCA 技术实时监测不同时间肠吸收药液的细胞动态变化，并得到其细胞指数⁃吸收时间曲线，即可建立一种以细胞指数为指标的肠吸收动力学模型考察吸收机制，这可弥补检测一种或几种化学指标成分评价中药口服制剂肠吸收机制的不足，给研究带来了新启发。

3 总结与展望

目前，中药肠吸收的实验研究方法种类很多，大致分为体内法、在体法、体外法，有各自特点和适用范围。其中，体内法以整体动物为研究对象，由于综合影响因素较大，不适用研究药物的吸收机制，更倾向研究药物体内的药动学特征；在体法在整体动物的基础上保证了血液、淋巴液的供应及肠道神经、内分泌状态的完好，并且降低了内容物的干扰因素，但也存在实验动物个体差异较大的问题，需要保证一定的实验动物数量以降低差异；体外法是脱离整体动物，选择剥离的肠段或细胞模型进行的肠道吸收研究，该方法操作简单，实验周期短，可用于药物早期高通量筛选，对肠道吸收机制的研究也较为方便。

目前，对中药肠吸收评价方法以指标性成分含量居多，利用其中单一或几种成分作为单味药或全方的代表进行肠吸收动力学研究，但并不具有整体性和科学性；采用中药指纹图谱评价中药肠吸收虽然可体现中药部分整体性，但易受色谱条件、化合物自身稳定性、多组分在同一条件适应性等因素的影响，并且使用的是单一分析方法和检测手段，所得到信息也是有限的。生物效应评价方法作为继性状评价、化学评价后推动中药质量标准走进临床、关联疗效的有效途径，但值得注意的是，该方法与指标成分定量评价、指纹图谱并不是替代与被替代的关系，而是相辅相成，应利用其各自优势取长补短，不断完善对中药质量的评价。